Производство и применение витаминов группы В

Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5 – 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 ч) начинает заметно накапливаться витамин В2, вначале – в мицелии, а затем – в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточной влажностью 8 %, содержащий 1,5 – 2,5 % рибофлавина, 20 % белка, тиамна, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления животных.

В случае высоких выходных показателей по рибофлавину, витамин можно выделять в индивидуальном состоянии и, наряду с синтетическим рибофлавином, использовать в медицине[8].

По другой схеме получение витамина В2 осуществляют следующим образом. В качестве посевного материала используются споры E.ashbyii, выращенные на пшене. Промытое пшено в течение 30 –35 мин выдерживают в молочной сыворотке для набухания, затем подсушивают и расфасовывают по 50 – 60 г в простерилизованные флаконы. Во флаконах пшено подвергается трехкратной стерилизации, после чего производят его засев водной суспензией спор культуры дрожжей. Флаконы с засеянной культурой в течение 7 – 8 дней инкубируют при 29 – 30 °С, после чего подсушивают в вакуум-сушильной установке и направляют для приготовления жидкого посевного материала, который после стерилизации подается в производственный ферментер.

Культивирование продуцентов рибофлавина проводят при 28 – 30 °С в течение 72 ч. Через каждые 8 ч по мере осуществления процесса ферментации отбирают пробы для контроля за развитием микробных клеток, составом среды и накоплением целевого продукта. Полученная культуральная жидкость по окончании ферментации содержит 1,4 мг/мл рибофлавина.

В целях стабилизации витамина в процессе высушивания культуральная жидкость подкисляется соляной кислотой до рН 4.5 – 5, после чего она концентрируется в вакуум-выпарной установке, производят дополнительную очистку на ионообменной установке; элюат затем выпаривают и полученный концентрат рибофлавина высушивают на распылительной сушилке.

Для Candida guilliermondii важно регулировать содержание железа в питательной среде; оптимальные концентрации колеблются, в среднем, от 0,005 до 0,05 мкг/мл. При этом определенные штаммы дрожжей могут образовывать за 5 – 7 дней до 0,5 г/л и более витамина. Однако для целей промышленного производства рибофлавина предпочитают использовать более продуктивные виды и штаммы грибов – E.ashbyii и Ashbyii gossypii[14].

              3.2.Схема получения витамина В12

Витамин В12 (цианкобаламин) представлен группой биологически активных веществ, содержащих в своем составе трехвалентный кобальт, аминные и цианистые группировки, которые могут быть замещены другими радикалами: – ОН-, Cl-, Br-.

Цианкобаламин получают только микробиологическим синтезом. Его продуцентами являются прокариоты и, прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных условиях образуют этот витамин. Мутанты Propionibacterium shermani М-82 и Pseudomonas denitrificans М-2436 продуцируют на жидкой среде до 58 – 59 мг/л цианкобаламина.

Учитывая важную роль витамина в организме человека, его мировое производство достигло 10 т в год, из которых 6,5 т расходуется на медицинские нужды, а 3,5 т – в животноводстве[15]. 

   Биотехнологическое производство кормовых препаратов витамина В12.

Для промышленного получения кормовых препаратов витамина В12 выращивается специально подобранный биоценоз микроорганизмов, осуществляющих термофильное метановое брожение, в который входят целлюлозоразлагающие, аммонифицирующие, углеводсбраживающие, сульфитвосстанавливающие и метанообразующие бактерии. На первом этапе ферментации этих микроорганизмов (в течение 10 – 12 дней) наблюдается бурное развитие термофильных аммонифицирующих и углеводсбраживающих бактерий, которое происходит в слабокислой среде (рН 5 – 7). Другие группы бактерий данного биоценоза достигают интенсивного развития при переходе брожения в щелочную среду (рН 7 - 8,5). Преобладающими в этот период являются метанообразующие бактерии, которые синтезируют в 4 – 5 раз больше витамина В12, чем другие микроорганизмы биоценоза. Главные субстраты для развития метанообразующих бактерий – жирные кислоты, низшие спирты, поэтому их добавление в питательную среду значительно увеличивает выход витамина.

Для приготовления питательной среды обычно используют барду ацетоно-бутилового производства, которая декантацией очищается от твердых примесей, в нее добавляется хлорид кобальта (4 г/м3 и 0,5 % метанола)[12].

В процессе промышленного культивирования бактерий вначале выращивают посевной материал (15 – 20 дней) в аппаратах вместимостью 250 м3. Затем посевной материал подают в железобетонные ферментеры вместимостью 4200 м3, в которых происходит метановое брожение. Свежую барду подают в нижнюю часть ферментера в количестве 25 – 30 % от его объема за сутки. Отбор метановой бражки, содержащей витамин В12, производится в верхней части ферментера. В течение рабочего цикла в ферментере строго контролируют рН среды, концентрацию летучих жирных кислот, содержание аммонийного азота, поддерживают оптимальную температуру (55 – 57 °С). В результате брожения образуется газовая смесь, состоящая главным образом из метана (65 %) и диоксида углерода (30 %), которая может быть использована как источник тепла.

Готовая культуральная жидкость, образующаяся как продукт ферментации, обычно содержит 2 – 2,5 % сухих веществ и 1,1 – 1,7 мг/л витамина В12. Для предотвращения разрушения витамина в процессе сушки культуральную жидкость подкисляют соляной или фосфорной кислотой до рН 6,3 – 6,5 и в нее добавляют 0,2 – 0,25 % сульфита натрия.

Полученная таким образом культуральная жидкость дегазируется, упаривается на вакуум-выпарной установке, полученный концентрат высушивают в распылительной сушилке до 5 – 10 %[4]. 

   Биотехнологическое получение высокоочищенного препарата       витамина В12.

Данный препарат получают микробиологическим способом с помощью стрептомицетов, продуцирующих антибиотики, пропионовокислых или метанобразующих бактерий. Впервые был синтезирован в 1972 г Р.Б. Вудвордом.

Витамин В12 получают путем культивирования Propionobacterium в анаэробных условиях, в периодическом режиме. Питательная среда содержит в своем составе: глюкозу, кукурузный экстракт, соли кобальта, сульфат аммония. рН питательной среды около 7,0, что достигается добавлением гидроксида аммония.

В процессе ферментации выделяются органические кислоты, которые нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Процесс культивирования длителен (продолжительность ферментации 6 суток); спустя 72 ч после начала культивирования в ферментер вносят 5,6-диметилбензимидозол (ДМБ) – предшественник витамина В12, в качестве затравки. Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому по окончании ферментации биомассу отделяют от культуральной жидкости методом сепарации. Витамин В12 экстрагируют из биомассы водой, подкисленной до рН 4,5 – 5 при температуре 85-90°C. Процесс экстракции длится приблизительно 1 ч; в воду вводят стабилизатор - 0,25 % раствор нитрита натрия для предотвращения уменьшения активности витамина. Затем раствор охлаждают, нейтрализуют до рН 6,8 – 7, добавляя гидроксид натрия; добавляют сульфат алюминия и хлорид железа в качестве коагулянтов белков, полученный раствор фильтруют с помощью фильтр-пресса, образующийся при этом фильтрат, содержит витамин В12, который очищают с помощью ионообменных смол. И после промывки, витамин В12 элюируют с ионообменной смолы аммиаком. Для обеспечения более глубокой очистки проводят экстракцию витамина органическими растворителями, после чего упаривают, концентрируют, снова очищают на колонке, заполненной оксидом алюминия, очищают ацетоном и выдерживают 1 – 2 суток при температуре 3 – 4 °C в результате чего выпадают кристаллы витамина В12, их отфильтровывают на холоде, промывают в ацетоне и сушат в экстракторе[3].

Кристаллический цианкобаламин можно получить с помощью резорцина или фенола.

           В процессе получения витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направлении удешевления компонентов питательных сред (замена глюкозы сульфитными щелоками) и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс. В последние годы исследуется возможность получения витамина с использованием иммобилизованных клеток пропионовокислых бактерий[5].

                      3.3.Получение фолиевой кислоты

В реактор вводят р-аминобензиол глутаминовую кислоту и 2,4,5-триамино-6-оксипиримидин-сульфат, добавляют воду (примерно 25-кратное количество к общей массе реагентов), нагревают до 500С и фильтруют через нутч-фильтр. Фильтрат направляют в сборник, а затем в реактор, охлаждают водой до 250С, добавляют ацетатного буфера, чтобы pH был равен 4,0 и 20%-ного едкого натра для нейтрализации серной кислоты. Затем вводят в реактор азот и при постоянном перемешивании небольшими порциями приливают 2,3-дибромпропионовый альдегид. По мере хода реакции выделяется HBr, который изменяет оптимальный pH. Поэтому непрерывно добавляют NaOH, следя за реакцией по индикатору.  Дибромпропионовый альдегид дабовляют в течении 2,5ч, затем массу перемешивают еще 60 минут без пропускания азота при охлаждении. После этого реакционную массу направляют в нутч фильтр, где осадок технической фолиевой кислоты отсасываю досуха, промывают на фильтре водой и спиртом, а затем направляют в вакуум-сушилку.

Маточный раствор упаривают в вакуум-аппарате до 50% объема, криссталлизуют на холоду при 00 в кристаллизаторе и отфуговываю в центрифуге. Промытый осадок отправляют в вакуум-сушилку.

Техническую фолиевую кислоту растворяют в 0,1н. растворе NaOH при температуре 400С. Раствор фильтруют через нутч-фильтр. Фильтрат поступает в смеситель, где его обрабатывают активированным углем в количестве 3-4% к массе технической фолиевой кислоты.

Затем отфильтровывают осадок угля, промывают разбавленным раствором щелочи. Фильтрат передают в реактор, куда вводят HCl; массу охлаждают до минус 30С и крисстализуют. Затем кристаллы отфуговывают в центрифуге, промывают осадок водой и спиртом. Получают получистую фолиевую кислоту.

Также применяют очистку фолевой кислоты путем ее растворения  в соляной кислоты и и осаждения при большом разбавлении солянокислого раствора водой.  Как щелочной, так и кислотный метод очистки не дают хороших результатов по качеству и выходу фолиевой кислоты. Качество фолиевой кислоты можно будет значительно улучшить, если удастся процесс осаждения заменить процессом кристаллизации, наример, путем растворения технического продукта в 0,1 н. HCl при температуре  75-800С и выкристаллизовании ее при минус 2-30С. Однако этот вопрос требует особого изучения[14].

                             ГЛАВА 4. ПРИМЕНЕНИЕ 

Витамины группы В применяются в клинической практике для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы, включая моно- и полиневропатии, энцефало- и миелопатии дефицитарного генеза, а также при системных заболеваниях, связанных с доказанным недостатком витаминов этой группы.

Витамины В1, В6, В12 в ряде случаев эффективны и при отсутствии их дефицита в связи с активным участием этих веществ в биохимических процессах, обеспечивающих нормальную деятельность структур нервной системы, например при диабетической полиневропатии, леченииболевых синдромов. Поэтому витамины группы В часто называют нейротропными. Кроме того, было обнаружено, что тиамин, пиридоксин и цианкобаламин в больших дозах проявляют новые лекарственные свойства, отличные от хорошо известного физиологического воздействия «природных» витаминов.

Так, пиридоксин оказывает положительное влияние на различные варианты эпилепсии, и при резистентных к лечению формах эпилепсии с очень ранним началом рекомендуется его назначение. Терапевтические дозы пиридоксина (от 50 мг/сутки) в некоторых случаях способны полностью прекратить приступы. Рибофлавин входит в число витаминов, часто добавляемых в белую муку и хлебобулочные изделия для того, чтобы компенсировать их потери при переработке. Он также используется для витаминизации молока, круп и диетических продуктов. Рибофлавин зарегистрирован в качестве пищевой добавки Е101

Витамины группы В широко используются для обогащения злаковых. Диетические продукты питания, такие как детские продукты и продукты для похудения обогащаются витаминами, в том числе пиридоксином. Большая часть синтетической фолиевой кислоты используется в качестве добавки к корму животных. Фолиевая кислота добавляется к различным пищевым продуктам, наиболее важными из которых являются зерновые для завтрака, питье, безалкогольные напитки и детское питание[13].

Пантотенат добавляется к различным пищевым продуктам, наиболее важным из которых являются зерновые для завтрака, напитки, диетические продукты и детское питание.

Пантенол часто используется в качестве косметического продукта. В составе средств по уходу за кожей пантенол способствует поддержанию кожи увлажненной и способствует ее питанию, а также - стимулирует рост клеток и восстановление ткани, кроме того он устраняет воспалительные процессы и покраснение кожи. Как увлажнитель и кондиционер в продуктах ухода за волосами, он защищает их и способствует восстановлению повреждений, вызываемых химическими или механическими воздействиями (расчесывание волос, мытье шампунями, завивка, окрашивание и так далее) и способствует блеску волос.