Псевдомонады

Чувствительность выделенных штаммов P.aeruginosa к антибиотикам определяют диск-диффузионным методом по унифицированной методике.

Дифференциальные признаки Pseudomonas aeruginosa и других

наиболее распространенных псевдомонад и неферментирующих бактерий

Питательные среды и тесты для диагностики синегнойной инфекции

Определение окисления и ферментации глюкозы на среде Хью — Лейфсона (O/F тест с глюкозой). Состав питательной среды (г/л): пептон — 0,2; хлорид натрия — 5,0; калий фосфорнокислый двузамещенный — 0,3; агар-агар — 3,0; бромтимоловый синий (1% водный раствор) — 3 мл, глюкоза — 10,0; вода дистиллированная — до 1 л; pH — 7,1-7,2. Среду разливают в пробирки по 5-6 мл, стерилизуют при 120оС 10 мин. Исследуемую культуру засевают в две пробирки уколом (не достигая дна пробирки), в одну из пробирок вносят стерильное вазелиновое масло слоем 1 см. Через 24 ч инкубации при 37оС учитывают результат: отсутствие изменения исходного зеленого цвета среды в обеих пробирках указывает на отсутствие окисления и ферментации глюкозы; появление желтой окраски среды только в пробирке без вазелина указывает на окисление глюкозы; появление желтой окраски среды под вазелиновым маслом указывает на ферментацию глюкозы.

Определение окисления углеводов и спиртов на среде Хью — Лейфсона. Используют питательную среду Хью — Лейфсона, содержащую вместо глюкозы 1% одного из исследуемых углеводов или спиртов. Среду разливают в пробирки высоким столбиком (7-8 см), стерилизуют при 120оС 10 мин. Исследуемую культуру засевают уколом, инкубируют при 37оС 24 ч. Появление желтой окраски только в верхней части среды указывает на окисление субстрата.

Определение барийчувствительности бактерий (по Сиволодскому Е.П., 1988).Предварительно для выбора рабочей концентрации хлорида бария в питательном агаре определяют методом серийных разведений в этой же среде МИК хлорида бария для контрольного штамма P.aeruginosa (желательно АТСС 27853). Рабочая концентрация хлорида бария равна четырехкратной МИК (г/л) для контрольного штамма. В последующем рабочую концентрацию хлорида бария определяют только при смене вида питательного агара. При постановке теста в расплавленный горячий стерильный питательный агар вносят навеску хлорида бария для получения рабочей концентрации, разливают среду в чашки Петри. Контрольной средой является тот же питательный агар без хлорида бария. Исследуемую культуру бактерий засевают радиальным штрихом на сектор среды с хлоридом бария (опыт) и питательного агара (контроль), инкубируют при 37оС 24 ч, после чего учитывают результат: отсутствие роста бактерий на среде с хлоридом бария при наличии роста на контрольной среде указывает на принадлежность бактерий к роду Pseudomonas.

Питательная среда "Псевдомонас-АПС" (по Сиволодскому Е.П., 1990). Состав питательной среды (г/л): сухой питательный агар 35,0; оксафенамид — 1,1 (растворенный в 10-12 мл диметилсульфоксида), вода дистиллированная — до 1 л; pH — 7,2-7,4. В колбу вносят 200 мл расплавленного горячего агара, добавляют 2,2 мл 10% раствора оксафенамида в диметилсульфоксиде, разливают среду в чашки Петри. Исследуемый материал засевают на сектор cреды, инкубируют при 42оС (или 37оС). Наличие колоний бактерий, выросших при 42оС указывает на принадлежность их P.aeruginosa. Колонии, выросшие при 37оС, принадлежат к видам P.putida и P.aeruginosa.

Определение цитохромоксидазы по Ковачу. На поверхность стеклянной чашки Петри наносят крупную каплю 1% водного раствора диметилпарафенилендиамина. Набирают запаянным изогнутым концом пастеровской пипетки часть газона испытуемой культуры (петлю из нихромовой проволоки применять нельзя) и помещают на сухую поверхность чашки рядом с каплей реактива. Перемещают той же пастеровской пипеткой каплю реактива на комочек культуры бактерий. Через 1 мин учитывают результат. При наличии цитохромоксидазы бактерии окрашиваются в красный цвет, при отсутствии цитохромоксидазы окраска бактерий не изменяется.

Среда Кинг А для выявления пиоцианина. Сухая коммерческая среда. Изготовление и приготовление по указанию на этикетке.

Среда Кинг В для выявления флюоресцеина. Сухая коммерческая среда. Изготовление и приготовление по указанию на этикетке.

Среда для определения нитратредуктазы. Состав: пептон сухой ферментативный — 2,5 г; хлорид натрия — 2,5 г; KNO3 (или NaNO3) — 0,5 г; вода дистиллированная — до 500 мл. Стерилизовать при 120оС 30 мин. Срок хранения до 5 лет.

Среду разливают по 0,1 мл в лунки планшета, вносят в лунку одну петлю исследуемой агаровой культуры, инкубируют при 37о С 3-4 ч. Затем вносят в лунку 1 каплю 0,2% водного раствора риванола и 1 каплю 10% раствора соляной кислоты. При наличии нитратредуктазы среда в лунке приобретает яркую темно-вишневую окраску, среда в контроле (без посева) сохраняет желтую окраску.

Определение лизиндекарбоксилазы и аргининдигидролазы. Исследование проводят микрообъемным ускоренным методом с жидкими средами в планшетах, используя среды и методику, применяемую для идентификации энтеробактерий.

 

Лечение и профилактика

Инфекции, вызванные синегнойной палочкой, плохо поддаются терапии в связи с множественной её резистентностью, передаваемой R-плазмидами. Механизмы резистентности: блокада транспорта препарата к внутриклеточной мишени (анатомические особенности поверхностных структур) и инактивация ферментами (бета-лактамазы инактивируют пенициллины и цефалоспорины, ацетилтрансфераза и нуклеотидаза инактивируют аминoгликозиды). В многоцентровом исследовании NPRS-3, синегнойная палочка отличалась очень высоким уровнем резистентности к гентамицину (61,3%), а также к пиперациллину, пиперациллину / тазобактаму, ципрофлоксацину. Наиболее активными в отношении P.aeruginosa являлись амикацин (резистентность 6,7%) и цефтазидим (резистентность 11,2%), меропенем (резистентность 3%)3.

В настоящее время наиболее эффективными антибиотиками при лечении синегнойной инфекции являются антипсевдомонадные цефалоспорины (цефтазидим, цефепим), карбапенемы (меропенем, имипенем); часто в лечении используются комбинации этих антибиотиков с фторхинолонами (ципрофлоксацин) или аминогликозидами (амикацин).

Особые трудности представляет профилактика синегнойной инфекции, так как возбудитель также часто устойчив к действию антисептиков и дезинфектантов. Более того, доказана возможность длительного сохранения возбудителя в растворах фурацилина, используемого для хранения катетеров и хирургического инструмента, а также для промывания ран.

Pseudomonas aeruginosa может вырабатывать вещества, способные нейтрализовать некоторые дезинфектанты. В то же время она чувствительна к высушиванию, действию хлорсодержащих дезинфицирующих препаратов, быстро погибает под действием высокой температуры и давления4.

Возбудитель устойчив к действию антисептиков и дезинфектантов, может сохраняться в растворах фурацилина, способен нейтрализовывать некоторые дезинфектанты, чувствителен к высушиванию, хлорсодержащим веществам, высоким температурам и давлению. Создана вакцина Aerugen, предназначенная для профилактики инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, разработанная фирмами Berna Biotech и Orphan Europe для применения у пациентов с муковисцидозом. Основным в профилактике внутрибольничных инфекций остается соблюдение правил асептики и антисептики.

 

 

Список литературы

 

1. Арутюнян С.И. Синегнойная палочка в носу. // Айболит. – 2006. – №2 (244) от 19 января.
2. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь – справочник. Минск: Асар, 1999.
3. Медицинская микробиология. / Под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. – М.: ГОЭТАР МЕДИЦИНА, 1998.
4. Митрохин С.Д. Значение синегнойной палочки в инфекционной патологии человека. // Инфекция и антимикробная терапия. – 2004. – №3. – Том 6.
5. Руководство по медицинской микробиологии. / Под ред. Т.В. Перадзе. Пер. с англ. М.: Медицина, 1982.
6. Сидоренко С.В., Яковлев С.В. Инфекции в интенсивной терапии. – М., 2000.
7. Состояние резистентности к антиинфекционным химиопрепаратам в России. / Под редакцией Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. – М.: Медицина, 2003.