Современные достижения в исследовании апоптоза

Действие гормонов опосредовано внутриклеточными специфическими рецепторами (для данных приведенных примеров). Рецептор, связывая лиганд, регулирует транскрипцию гормоночувствительных генов. Это могут быть гены, продукты которых регулируют продвижение клетки по клеточному циклу или апоптоз- специфические гены. Другими важными физиологическими регуляторами апоптоза являются цитокины. Цитокины - это обширная группа белков, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток при связывании со специфическими рецепторами на клетках мишенях. В отличие от гормонов, цитокины действуют, в основном, на пара- и аутокринном уровне. Цитокины подразделяются на 3 большие группы (в зависимости от структуры и функции): ростовые факторы (колониестимулирующие факторы, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста и т.д.), семейство Фактора некроза опухоли (ФНО) и спиральные цитокины (интерлейкины, интерфероны). Эффект цитокинов на клетки также неоднозначен: для одних клеток они выступают в роли индуктора апоптоза, для других - в роли ингибитора апоптоза. Это зависит от типа клетки, от стадии ее дифференцировки, от функционального состояния клетки.

Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетку к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства ФНО со специфическими рецепторами. Ярким представителем этой группы белков является система Fas/Fas-L. Следует отметить, что для этой системы не известны другие функции, кроме как индукции апоптоза клетки. Fas/APO-l/CD-95 -рецептор, по структуре, относящийся к рецепторам семейства ФНО. Взаимодействие Fas с Fas-L (лиганд) или с моноклональными антителами приводит к апоптозу клетки. Fas конститутивно экспрессируется на поверхности клеток многих типов: на тимоцитах, лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В- лимфоцитах, а также на фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах, миелоидных клетках. Ген Fas у человека локализован в длинном плече хромосомы 10 и состоит из 9 экзонов.

Fas-L является цитокином и относится к семейству цитокинов ФНО. Fas-L экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах, а также на клетках Сертоли и паренхимных клетках передней камеры глаза, что позволяет этим клеткам убивать любую Fas- экспрессирующую клетку, в том числе и активированный Т-лимфоцит. Этот механизм определяет появление защищенных от иммунной системы мест.

Важная роль в регуляции апоптоза клеток иммунной системы принадлежит другим цитокинам -интерлейкинам, интерферонам. Интенсивно ведутся работы по выяснению апоптогенного действия интерлейкинов (ИЛ). Было обнаружено, что они являются индукторами апоптоза как в здоровых, так и в онкологических клетках и клеточных линиях. Например, ИЛ-12 индуцирует апоптоз натуральных киллеров, ИЛ-4 и ИЛ-10 - периферических моноцитов человека, ИЛ-10 - Т-лимфоцитов. Однако не только роль индукторов апоптоза свойственна интерлейкинам, не менее выраженный эффект цитокинов наблюдается в предотвращении апоптоза. При этом один и тот же ИЛ может быть как индуктором апоптоза, так и его ингибитором. Различия в ответе клеток наблюдаются для разных клеток-мишеней и, возможно, зависят от степени их дифференцировки и развития. Так, например, ИЛ-1 является индуктором апоптоза для клеток мышиной тиомы в случае ингибирования размножения клеток (фаза плато на кривой роста) и ингибитором апоптоза для этих же клеток в случае их интенсивного размножения (фаза роста). ИЛ-2 является ингибитором апоптоза Т-лимфоцитов, В- лимфоцитов. ИЛ-4 также ингибирует апоптоз Т-лимфоцитов и В- лимфоцитов. ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-9 известны только как ингибиторы апоптоза клеток.

Неоднозначна и роль интерферонов (ИФ) по влиянию на клетки. В одних случаях ИФ вызывает апоптоз (клетки костного мозга), в других - является ингибитором апоптогенного сигнала (периферические моноциты человека).

Эндогенным условием развития апоптоза может быть повышение внутриклеточного уровня Са2+, которое моделируется действием кальциевых ионофоров.

В последнее время особое внимание исследователей в развитии апоптоза в условиях гипоксии миокарда привлек протоонкоген c-myc.  Этот онкоген участвует в пролиферации как нормальных гладкомышечных клеток, так и, очевидно, вносит существенный вклад в патологию. В частности, деление гладкомышечных элементов в процессе развития атеросклероза является c-myc-зависимым. В гладкомышечных клетках, выделенных из атеросклеротических бляшек, содержание c-myc м-РНК оказалось выше, чем в нормальных гладкомышечных клетках.

Еще один фактор, играющий роль во включении механизма апоптоза, — это р53. Этот белок называют онкосупрессором, поскольку его присутствие приводит к гибели клеток с нарушениями в геноме, тогда как при мутациях гена р53 такие клетки выживают и часто становятся источником злокачественного роста. Белок р53 участвует также в индукции радиационного апоптоза. В норме белок р53 не экспрессируется; его экспрессия индуцируется облучением, действием противоопухолевых химиопрепаратов и ряда других агентов. Пока неясно, каким образом он воспринимает сигнал о разрывах ДНК и других генетических нарушениях.

Интересные данные касаются регуляции апоптоза пептидными ростовыми факторами. Имеются убедительные сведения о том, что факторы роста предотвращают развитие апоптоза в клетках. Удаление факторов роста из культуры клеток приводит к типичным апоптотических проявлениям.

Индукторами апоптоза являются также активные формы кислорода, появляющиеся в клетках в патологии. При этом, если клетка не может справиться с патологией другими механизмами запускается в последнюю очередь механизм апоптоза.

Обобщить все выше сказанное поможет таблица (см. таб. 2).

Таблица 2. Активаторы и ингибиторы апоптоза

Таким образом, наличие в организме физиологических факторов -индукторов и ингибиторов апоптоза позволяет сделать вывод, что программированная гибель клетки зависит от соотношения факторов, вызывающих апоптоз и предотвращающих его, а также от регуляторных внутриклеточных механизмов. Необходимо также отметить, что индуцируют апоптоз как физиологические, так и патогенные факторы, отсюда можно предположить, что в зависимости от природы фактора и будет выявляться значение апоптоза.

Механизм апоптоза

В настоящее время складывается впечатление о центральной роли протеаз в запуске и развитии процесса апоптоза. Причем при апоптозе действуют свои, характерные только для апоптоза, специализированные необратимые реакции протеолиза, катализируемые специфическими протеазами, относящихся к классу цистеиновых протеаз. Эта группа протеаз, названная каспазы (caspases), существует обособленно и функционирует как медиатор сигнала смерти. С - отражает механизм протеолиза. Т.е. в активном центре находится цистеин. Асп - обозначает аспарагиновую кислоту, которая узнается как субстрат, пептидная связь после нее подвергается гидролизу. Аза - окончание, свойственное ферментам. К настоящему времени в различных клетках млекопитающих обнаружено 10 каспаз, образующих ферментативный каскад, подобно ферментативному каскаду свертывающей системы крови или системы комплемента. Каспазы имеют высокую степень гомологии по своей аминокислотной последовательности, схожи по структуре и по субстратной специфичности. Они синтезируются в виде проферментов (30-50 кД), которые содержат 3 домена: N-концевой домен, большую субъединицу (20 кД) и малую субъединицу (10 кД). Во время активации каспазы подвергаются протеолитическому отщеплению N-концевого домена, отличающегося наибольшей вариабельностью как по размерам, так и по аминокислотной гомологии.

Этот процессинг между доменами сопровождается ассоциацией большой и малой субъединицей в гетеродимер с формированием активного центра. Кристаллическая структура двух каспаз (caspase-1 и caspase-3) определена: в обоих случаях гетеродимер ассоциирован в тетрамер с формированием 2 каталитических сайтов.

Среди каспаз различают эффекторы, т.е. ферменты непосредственно гидролизующие структурные белки клетки, и индукторы - каспазы, которые принимают апоптотический сигнал и передают его на эффекторные каспазы. Среди молекулярных мишеней каспаз - эффекторов известны многие белки, деградация которых вызывает развитие необратимых процессов, характерных для апоптоза. Каким образом происходит регуляция активности каспаз в интактной клетке? Каспазы присутствуют в клетке конституционно (даже в нейронах, которые не обновляются на протяжении всей жизни), что позволяет индуцировать апоптоз быстро. Один из путей активации каспаз связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы-8 при взаимодействии Fas - лиганда с Fas-рецептором). Другой путь - активация каспазы-9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Вс1-2 (будет рассмотрено далее). Третий путь активации каспаз - при помощи гранзимов В - сериновой протеазы. Такой путь активации каспаз актуален в случае индукции апоптоза клетки цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые и секретируют эти ферменты. При таком способе активации каспаз необходимо присутствие порообразующих белков перфоринов, продуцируемых также цитотоксическими Т-лимфоцитами. В качестве мишеней гранзимов В известны каспазы 1, 3 и 9.

Одно из апоптотических событий реализуется в ядре клетки и заключается в фрагментации ДНК (Рис. 1,2). Деградация ДНК является терминальной фазой апоптоза. В ходе деградации ДНК сначала происходит образование крупных фрагментов, содержащих примерно 300 тыс. пар оснований (п.о.), несколько позже - 30-50 тыс.п.о. Далее наступает следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, с формированием фрагментов, содержащих 180 пар оснований (протяженность нити ДНК в нуклеосоме) или кратных им по величине. Именно эти фрагменты выявляются в виде "лесенки" при электрофорезе ДНК лизатов апоптотических клеток, который широко используется для идентификации апоптоза. Такая фрагментация ДНК связана с протеолитическим расщеплением специфического белка топоизомеразы II. Это белок выполняет структурную и ферментативную функции и участвует в формировании структур ДНК высшего порядка - суперспирализованных петель. Они содержат по 50 тыс. п.о. Шесть петель, объединенных в единую дисковидную розетку, образуют еще более сложную структуру и имеют в своем составе соответственно по 300 тыс. п.о. Следует напомнить, что именно на фрагменты по 50 и 300 тыс. п.о. расщепляется ДНК в начальной стадии деградации при апоптозе. Деградация топоизомеразы II каспазами является одной из причин фрагментации ДНК.

Также субстратом протеаз при апоптозе является гистон H1, который защищает ДНК от действия эндонуклеаз на межнуклеосомальном уровне. В результате этого расщепления происходит деградация ДНК на фрагменты порядка 180 п.о. и кратные им.

Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности различных эндонуклеаз. Мало сведений о характеристике эндонуклеаз, обусловливающих появление крупных фрагментов ДНК. Немногим больше сведений о процессах межнуклеосомальной деградации ДНК, в результате которой образуются фрагменты ДНК размером 180 п.о. Считают, что этот тип деградации обеспечивается активацией Са2+, Mg2+-зависимой эндонуклеазы.

Вследствие изменений в мембране,клетка распознается фагоцитом и поглощается без возникновения перифокального воспаления.

Таким образом, апоптоз - это активный процесс, связанный с белковым синтезом. Кроме того, необходимо обратить внимание, что это генетически детерминированный процесс. Генетическая детерминированность показывает естественность этого процесса для организма. Отсутствие развития аутолиза и вследствие этого отсутствие перифокального воспаления, а также повреждения других клеток делает программированную гибель наиболее благоприятным методом утилизации клеток. Затраты энергии на проведение активных процессов в клетке и крайняя мера – гибель самой клетки безусловно должны иметь немалую значимость для организма.

Значение апоптоза

В наиболее общей форме назначение апоптоза (в сочетании с его альтернативой — пролиферацией) состоит в определении размеров и “архитектуры” организма, что проявляется: в поддержании постоянства численности клеток; в определении формы организма и его частей; в обеспечении правильного соотношения численности клеток различных типов; в удалении генетически дефектных клеток.

Роль программированной гибели при генетических дефектах трудно переоценить. Апоптоз не только контролирует деление и соответственно численность клеток, о чем будет сказано ниже, но и способствует сохранению постоянства генофонда целых популяций.

Наиболее простой иллюстрацией значимости апоптоза для многоклеточного организма являются данные о роли этого процесса в поддержании постоянной численности клеток нематоды Caenorhabditis elegans, о чем уже упоминалось в связи с генетическим контролем апоптоза. Для этого вида свойствен очень жесткий контроль общей численности клеток. Показано, что этот гомеостаз обеспечивается путем апоптоза части клеток. Его индукция и осуществление контролируются набором из 14 генов, из которых один (ces-1) обусловливает выбор апоптического пути, два (ced-З и ced-4) — его реализацию, а остальные или ингибируют апоптоз, или отвечают за фагоцитоз и расщепление погибших клеток.

Примером проявления апоптоза в поддержании численности отдельных клеточных популяций может служить увеличение численности эндотелиальных клеток и размера сосудов у мышей с прицельной инактивацией (“нокаутом”) гена Braf, контролирующего апоптоз эндотелиальных клеток у мышей. In vitro регуляция численности клеток в популяции проявляется в индукции их апоптоза при достижении определенного уровня плотности.

Роль апопоза в формообразовании иллюстрируют результаты исследования локализации апоптотических клеток в процессе морфогенеза внутреннего уха у куриных эмбрионов. Апоптозу подвергаются клетки тех участков закладки внутреннего уха, которым предстоит участвовать в формировании полуциркулярных каналов. Подавление апоптоза путем гиперэкспрессии гена bcl-2 обусловливает задержку или отсутствие формирования просвета названных каналов. Морфогенетические аномалии, связанные с блокадой апоптоза, могут быть вызваны также ингибированием биохимических процессов, лежащих в основе апоптоза. Так, ингибиторы каспаз задерживают закрытие нейральной трубки у куриных эмбрионов.

Роль апоптоза в дифференциации отдельных частей органов и их формообразовании изучается на примере становления в эмбриогенезе органов, особенно почки и головного мозга. Особенно пристальное внимание привлекает в этом контексте процесс формирования коры головного мозга. Так, у человеческого плода критическим периодом кортикогенеза является срок с 12-й до 23-й недели беременности, когда происходит интенсивная пролиферация клеток вентрикулярной зоны и миграция нейронов. Наиболее интенсивный апоптоз регистрируется в постмитотических клетках вентрикулярной зоны и вдоль путей миграции нейронов в промежуточной зоне; он отсутствует в кортикальной пластинке. Роль апоптоза при этом сводится к селекции клеток, которым предстоит участвовать в формировании коры. Другим примером селективного апоптоза определенного типа клеток может служить массовая гибель (апоптоз) интернейронов (но не мотонейронов) серого вещества спинного мозга крыс вскоре после рождения.