Телевизионная визуализация в биологии и медицине

Современные микроскопы, как правило, имеют отдельный оптический адаптер  для установки фото или видеокамеры (рис.7.9а), дающий возможность как телевизионного, так и бинокулярного наблюдения. Однако, в такой схеме имеются потери света в результате деления светового потока на два канала – визуальный и телевизионный.

При отсутствии отдельного оптического канала камера может быть установлена непосредственно вместо окуляра (рис.7.9б). Для этого необходимо либо разместить плоскость фотоприемника в фокальной плоскости окуляра микроскопа, либо обеспечить перенос оптического изображения на фотомишень через дополнительный объектив переноса. При этом, если размер изображения превышает размер фотоприемника, то получается дополнительное масштабирование изображения. В данной схеме меньше потерь света, однако, возникает определенное неудобство для визуального наблюдения через окуляр микроскопа.

 

а)          б)

Рис.7.9. Структурная схема микроскопа с оптическим адаптером для присоединения  ТВ-камеры – а) и микроскопа с ТВ-камерой, установленной вместо окуляра – б).

 

На рис.7.10 показан внешний  вид микроскопа с подключенной к  нему телевизионной камерой. Камера с комплектом сменных тубусов  обеспечивает возможность наблюдения на экране монитора черно-белых или  цветных изображений объектов, исследуемых при помощи стандартных микроскопов: МБС-1, Биолам, МБС-2, Биолам-И, МБС-9, Люмам-И1, МБС-10, МСПЭ-1, МБИ-15-2, МСП-2.

 

Рис.7.10. Внешний вид  стандартного микроскопа с телевизионной  камерой, установленной на окуляр и  изображение наблюдаемого микротекста.

 

Как правило, телевизионную  систему адаптируют к спектру  поглощения исследуемого объекта. Например, ультрафиолетовый телевизионный микроскоп  позволяет более детально визуализировать  клеточные структуры, поглощающие  ультрафиолетовое излучение. При прочих равных условиях УФ-микроскоп дает более высокое разрешение, поскольку УФ-лучи являются более коротковолновыми. Некоторые вещества, не пропускающие видимый свет, прозрачны для инфракрасного света (ИК-микроскопия).

 

Спектрозональные телевизионные  микроскопы

 

Аналогично спектрозональному  рентгенотелевизионному устройству может  быть создан спектрозональный телевизионный  микроскоп [32]. Используется метод цветовой трасформации, при котором получают цветное изображение объекта, полученное путем смешения трех основных цветов (R,G,B) яркость которых пропорционально пропусканию (поглощению) объекта в трех различных участках спектрального диапазона.

Например, для УФ области  спектра можно применить следующее  цветное кодирование: зеленый для  УФ-А (254нм), красный для УФ-В (302нм) и синий для УФ-С (365нм).

При таком кодировании, в частности, обеспечивается более  эффективное выявление клеточной  структуры биологических препаратов, так как ядра клеток, содержащие нуклеиновые кислоты, поглощают  коротковолновый УФ в большей  степени, чем цитоплазма.

 

7.6.Телевизионные  системы для демонстрации хирургических  операций

 

Это одно из первых применений телевидения в медицине, причем, с целью обучения [32]. Основная задача - демонстрация хода операции большому числу зрителей. Понятно, что в операционной зрителей быть не должно из-за требований стерильности и ограниченного объема операционной.

Основные требования к таким системам:

1. качество цветопередачи,
2. разрешающая способность,
3. возможность плавного оптического масштабирования (“наезд”-“отъезд”).

 

Аппаратура отличается главным образом конструктивным выполнением. Как правило, это совмещенные  камеры с хирургическим светильником, который поворачивается вместе с  камерой. Параметры камер должны быть близки к вещательному стандарту. В операционных обычно используются, так называемые, бестеневые лампы с расположеннными по кругу светильниками, создающими достаточно большую освещенность рабочего поля. Управление камерой осуществляется дистанционно. Современные системы позволяют наблюдать в том числе такие крупные планы, как хирургическая игла с ниткой. Качество цветопередачи позволяет не только различать оттенки тканей, но и их изменение во время операции.

Приемная часть оборудуется  часто проекционными экранами для  демонстрации процесса большой аудитории. Телевидение позволяет не только обучать, но и может быть использовано для передачи изображения по сети, в том числе, Интернет для участия в ходе операций других специалистов с целью оказания консультационной помощи.

 

Рис.7.11. Структурная схема телевизионной системы для демонстрации хирургических операций.

 

 

10. Телевизионная визуализация  и обработка изображений продуктов  полимеразной цепной реакции  (ПЦР)

 

В настоящее время  метод ПЦР находит все большее  применение в медицинской диагностике [45,46]. Наиболее быстро развиваются следующие направления:

1. диагностика инфекционных заболеваний;
2. диагностика онкологических заболеваний;
3. диагностика наследственных заболеваний;
4. диагностика в неонатологии;
5. диагностика в пульмонологии и фтизиатрии;
6. применение ПЦР в практике службы крови;
7. идентификация личности (судебная медицина, криминалистика,
8. трансплантация органов и тканей, определение отцовства);
9. диагностика патогенов в пище.

Методика проведения ПЦР предусматривает следующие  этапы:

1. выделение ДНК из биологического материала;
2. непосредственно проведение ПЦР (амплификация);
3. электрофорез в геле;
4. детекция результатов электрофореза.

С получением и анализом изображений связан последний этап. В настоящее время для детекции ПЦР-продуктов применяется их окрашивание специальными люминесцирующими красителями. К наиболее известным  из них относятся Ethidium Bromide (этидийбромид), Fluorescein, Radiant Red, Texas Red, SYBR Green, Ribo Green , Pico Green. Красители обладают специфическими прокрашивающими свойствами, различными квантовыми выходами, спектральными характеристиками и адаптированы для различных приложений ПЦР.

Приведем некоторые  сведения об эмиссионных и спектральных свойствах вышеперечисленных красителей. Так, например, краситель Ribo Green имеет линейную зависимость между флуоресценцией и концентрацией РНК в диапазоне от 1,0 нг\мл до 50 нг\мл, в два раза больший квантовый выход для РНК по сравнению с этидийбромидом (ЭБ), а краситель Pico Green имеет линейную характеристику в диапазоне от 25 пг\мл до 1000нг\мл. Максимум люминесценции Ribo Green – 530нм при максимуме спектра поглощения 485нм.

Весьма популярными  красителями являются Fluorescein и SYBR Green, люминесцирующие в зеленой области спектра, а также Radiant и Texas Red, люминесцирующие в красной области спектра под воздействием ультрафиолетового излучения 302нм. Применение данных красителей позволяет различать образцы в геле по цвету люминесценции. В распоряжении исследователей имеются специальные наборы красителей, обладающие избирательными свойствами по отношению к структурам ДНК и позволяющие дифференцировать их по цвету в диапазоне длин волн от 450 до 700нм с шагом порядка 30нм.

Вместе с тем в  настоящее время наиболее распространенным и доступным красителем для ДНК  является ЭБ. Остановимся более подробно на его характеристиках.

Окрашенные ЭБ ДНК  имеют оранжево-красную флуоресценцию  в области 590-610нм. При взаимодействии с нативными ДНК и РНК квантовый  выход флуоресценции ЭБ возрастает, соответственно, в 100 и 46 раз. Увеличение квантового выхода ЭБ специфично и линейно в широких пределах, что позволяет применять его для обнаружения малых количеств ДНК и РНК.

Применение ЭБ позволяет  обнаруживать от 0,1 до 50нг ДНК в полосе для полиакриламидного геля. Для  выявления количества ДНК в геле пластину геля выдерживают в растворе ЭБ, затем облучают ультрафиолетовым светом в области 256 –315нм и по интенсивности флуоресценции судят о количестве ДНК.

Рис.10.1. Спектр флуоресценции  этидийбромида (слева) и ее зависимость  от концентрации ДНК (справа).

 

Для оценки размеров фрагментов ДНК в молекулярной биологии широко используются молекулярные маркеры - последовательности ДНК с известными количественными  характеристиками: размерами фрагментов (обычно в парах оснований - п.о. или, так называемых, базовых парах b.p., или в количестве нуклеотидов) и количеством содержащихся в них ДНК (обычно в мкг, нг или пг). Молекулярные маркеры - это своеобразные масштабные и градационные линейки, которые могут быть помещены в гель для оценки количественных характеристик исследуемой ДНК по характеру распределения в геле и интенсивности свечения фрагментов.

На рис.10.2 приведен пример распределения молекулярного маркера  в геле, а на рис. изображение геля, содержащего молекулярный маркер.

Рис.10.2. Пример распределения в геле фрагментов молекулярного маркера 100b.p. DNA Ladder с размерами от 1000 до 100п.о. с шагом 100п.о.

 

1     2     3     4    5    6    7    8     9   10   11 12

Рис.10.3. Изображение геля с молекулярным маркером (дорожка 8).

 

Как правило, фрагменты  молекулярного маркера имеют  нелинейное распределение в геле. При этом отношения координат  фрагментов маркера в геле являются инвариантными к условиям электрофореза.

На практике традиционно  используют визуальный и фотографический методы детекции результатов электрофореза.

При визуальном методе гель просматривают непосредственно  в УФ-свете, субъективно оценивая результат по интенсивности и  положению светящихся фрагментов.

При фотографическом  методе полученный гель фотографируют, проводя дальнейшую диагностику по фотоснимкам. С помощью сканера возможна передача фотоснимков в компьютер с целью обработки  и создания базы данных. Метод весьма чувствителен при применении специальных фотографических материалов, но требует определенных затрат времени на фотосъемку и обработку, что часто исключает возможность повторной съемки из-за относительно короткой жизни геля.

Замена фотографического метода визуализации телевизионным  позволяет получать изображения  в реальном времени, использовать цифровую обработку изображений, а также автоматизировать процесс определения количественных показателей (например, количество и размер  ДНК в полосе свечения) и диагностики, осуществлять ведение базы данных.

Нижний предел количества ДНК, при котором возможна денситометрия, определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание этидийбромидом, то предел визуального обнаружения соответствует 10ng. Что касается верхнего предела, то слишком большое количество ДНК на дорожке приводит к заниженным оценками (точность совсем низкая, начиная приблизительно с 0.5 µg). Оптимальный диапазон для денситометрического определения: 0.02-0.15 µg на полоску. При денситометрии следует также иметь ввиду, что ДНК легко теряет ЭБ особенно при повышении температуры.

Рассмотрим принцип  построения моноспектральной системы  для визуализации вторичной люминесценции  ПЦР продуктов, окрашенных бромидом этидия и флуоресцеином (рис.). Вторичная  люминесценция бромида этидия и  флуоресцеина возбуждается за счет свечения агарозы (полиакриламида) геля, вызываемого в свою очередь УФ излучением.

Рис.10.4. Спектральные характеристики компонентов, выделяющих спектр люминесценции  бромида этидия.

Максимум спектра люминесценции 690 нм приходится, с одной стороны, на максимум чувствительности фотоприемника, а, с другой стороны, на максимум паразитного «красного хвоста» светофильтра С₁(l) типа УФС. Для формирования С₂(l) оптимальной комбинацией стандартных светофильтров является  пара светофильтров ОС-14 и СЗС-23.

Флуоресцеин люминесцирует в области спектра с максимумом 510нм. Поэтому для него оптимальной комбинацией стандартных светофильтров является  пара светофильтров ЖС-16 и СЗС-23.

 

Рис.10.5. Спектральные характеристики компонентов, выделяющих спектр люминесценции  флуоресцеина.

 

Данные о спектрах поглощения чистого бромида этидия и бромида этидия, интерколированного в ДНК, позволяют предложить вариант  построения моноспектральной системы  для визуализации первичной люминесценции  данного типа красителя. Такая система  обладает принципиально лучшими характеристиками по чувствительности и контрастности получаемого изображения по сравнению с выше рассмотренной, поскольку в ней минимизируется паразитная засветка в области «красного хвоста» и исключается люминесценция геля, создающая фоновую засветку. В результате система за счет улучшения спектральных характеристик С₁(l) , С₂(l) может быть приближена к идеальной. На рис. представлен спектр поглощения бромида этидия, что соответствует правилу Левшина о симметричности спектров поглощения и люминесценции.

Рис.10.6. Спектр поглощения –1 и люминесценции -2 бромида этидия.

 

Вариант разделения спектров поглощения и люминесценции для  данного случая стандартными светофильтрами представлен на рис.10.7 Спектр поглощения бромида этидия выделяется светофильтром СЗС-22, а спектр люминесценции светофильтром КС-11.

Рис.10.7. Принцип выделения первичной  люминесценции бромида этидия.

 

Аналогичным образом  может быть предложен вариант  моноспектральной системы для визуализации первичной люминесценции флуоресцеина. На рис.10.8 представлен спектр поглощения флуоресцеина, что соответствует правилу Левшина о симметричности спектров поглощения и люминесценции. Вариант разделения спектров поглощения и люминесценции для данного случая с помощью стандартных светофильтров представлен на рис.10.9.