Телевизионная визуализация в биологии и медицине

Рис.10.8. Спектр поглощения –1 и люминесценции –2 флуоресцеина.

Рис.10.9. Принцип визуализации первичной  люминесценции флуоресцеина.

 

 Спектр поглощения  флуоресцеина выделяется светофильтром  СЗС-20, а спектр люминесценции светофильтром ЖС-16. Следует отметить, что данный вариант разделения имеет существенные области взаимного перекрытия спектральных характеристик, что создает значительные паразитные засветки фотоприемника.

 

Методы  количественного анализа изображений  люминесцирующих продуктов ПЦР в гелях

 

Одной из наиболее важных задач при  исследовании при исследовании ПЦР-продуктов  в гелях является получение оценок количества и размеров ДНК, содержащейся в люминесцирующих фрагментах, полученных в результате электрофоретического разделения проб [45-48].

Количество ДНК - M пропорционально интенсивности – I свечения фрагмента и может быть определено как M= f( ), где n - количество пикселей во фрагменте.

При электрофорезе ПЦР - продукты распределяются в геле в порядке убывания их размера (молекулярной массы). Таким образом, размер  L  ДНК, является функцией расстояния  S между координатами фрагмента и его стартовой лунки: L= f(S) .

Для оценки размеров и количества ДНК в реальных единицах, например, в нг и, соответственно, в парах оснований (п.о.), могут быть использованы молекулярные маркеры с известными значениями  L  и M. Размещая маркер в геле и проводя электрофорез с исследуемыми ПЦР - продуктами, получают маркерную линейку, которую можно использовать для калибровки измерительной системы.

Зависимости M= f(I) и L= f(S) имеют, как правило, нелинейный характер. В диссертации предлагается использовать метод кусочно-линейной аппроксимации, позволяющий минимизировать таблицу функций и соответствующих им аргументов до количества фрагментов, имеющихся в применяемом молекулярном маркере. При этом каждому интервалу между соседними фрагментами как для значений  L, так и для значений  M могут быть поставлены в соответствие свои расчетные значения коэффициентов a  и b  для элементарной функции y = ax + b .

Рис.10.10. Распределение  фрагментов ДНК в молекулярном маркере

 p -GEM DNA [51-1198 b.p.]

L, мм	0	18	32	42	49	58	82	91	108	132	142	148
L ,п.о.	1198	678	517	460	390	350	222	179	126	75	65	51

 

На рис. показан пример кусочно-линейной аппроксимации зависимости молекулярной массы ДНК от координат фрагментов для молекулярного маркера P GEM DNA.

Удобной формой для сравнения распределения  проб, содержащихся в соседних дорожках геля, являются профилограммы распределения интенсивности свечения ПЦР-продуктов вдоль заданной линии.

Возможно два режима задания  линий для построения профилограмм: интерактивный и автоматический. В интерактивном режиме выбор  положения производится путем ручного (манипулятором типа «мышь») перемещением маркерной линии по экрану дисплея и фиксации ее положения при визуальном совмещении с исследуемой дорожкой геля. В автоматическом режиме положение маркерных линий устанавливается в соответствии с распределением дорожек автоматически путем анализа изображения геля. Вдоль заданной линии в каждом пикселе изображения производится измерение интенсивности свечения и построение графика ее распределения – профилограммы.

С целью сглаживания профилограммы  применяется усреднение значений для  пикселей в линиях, находящихся в заданной окрестности профилограммы, а также усреднение значений для соседних пикселей маркерной линии. Иными словами, осуществляется дополнительная цифровая обработка в скользящем окне с заданными размерами.

На рис.10.11 приведен пример изображения геля с построенными для выделенных дорожек профилограммами.

  

Рис.10.11. Изображение геля и профилограммы распределения  интенсивности свечения ПЦР продуктов  вдоль выделенных линий .

 

Построение профилограммы с  целью сглаживания целесообразно  сопровождать операцией дискретной свертки в скользящем вдоль профиля окне с вычислением среднего значения отсчетов яркости для каждого положения скользящего окна: I_ср=[1/(mxn)][H], где H=mxn маска из mxn элементов, причем, m=2k+1, n=2k+1.

Координаты максимумов профилограммы позволяют определить размер фрагментов ДНК, а значения максимумов могут быть использованы в качестве грубой оценки количества ДНК, содержащейся во фрагменте. Для более точной оценки количества ДНК необходимо производить выделение фрагмента и суммирование значений интенсивностей его пикселей.

Как и при построении профилограмм возможно два режима работы: интерактивный и автоматический. В интерактивном режиме производится формирование прямоугольной рамки  с регулируемыми размерами, перемещаемой по экрану монитора с помощью манипулятора. Границы рамки устанавливается с небольшим превышением внешних границ люминесцирующих фрагментов, размер которых в геле приблизительно одинаков. При совмещении центра рамки с центром изображения исследуемого фрагмента производится подсчет суммарной интенсивности свечения пикселей, попавших в рамку. Фиксация центра рамки, совпадающего с центром фрагмента, обеспечивает одновременно получение значения координаты фрагмента, пропорциональной его размеру.

При автоматическом режиме производится анализ изображения и определяются координаты центров тяжести фрагментов, в которые последовательно выводится центр рамки заданных размеров и производится суммирование пикселей изображения, попавших в ограничиваемое ею окно.

Результаты измерений запоминаются в виде таблицы, в которой указывается порядковый номер фрагмента и его количественные характеристики. Ниже показан пример окна программы с изображением геля выделенными фрагментами и результатами количественного анализа, представленными в табличной форме.

Рис.10.12. Таблица результатов  измерений количества ДНК, в указанных  фрагментах изображения геля.

 

Как следует из вышеизложенного, количество ДНК фактически есть не что иное, как условный объем трехмерной фигуры, границы которой определяются формой видеосигнала, получаемого при сканировании изображения анализирующей апертурой передающего устройства телевизионной системы (рис.10.13).

 

Рис.10.13. Распределение энергии  сигнала в пятне, соответствующем люминесцирующему фрагменту ДНК.и трехмерная (3D) модель части изображения геля, содержащего пробы ДНК с различными интенсивностями свечения, отображаемыми по вертикальной координате (высоте) модели.

 

Определение условного объема и  пропорционального ему количества ДНК, содержащегося в люминесцирующем фрагменте, осуществляется либо путем суммирования отсчетов яркости, превышающих заданный порог, при автоматическом анализе, либо путем суммирования отсчетов яркости, попавших в измерительную рамку, при интерактивном анализе.

 

Информационные  технологии в диагностике инфекционных заболеваний методом ПЦР

Автоматизированная  диагностика

В диагностических ПЦР-лабораториях, при большом потоке пациентов, медицинскому персоналу требуются значительные трудозатраты для заполнения текущего журнала входными данными. Опыт работы ведущих диагностических центров г. Москвы показывает, что ежедневно необходимо вручную обрабатывать сведения о 300-500 пациентах, каждый из которых диагностируется на 3-10 инфекций, и в зависимости от количества и разнородности диагностируемых инфекций распределять клинические материалы в гелях.

Сокращение трудозатрат путем  автоматизации процессов регистрации  пациентов и результатов исследований, учёта дорогостоящих клинических  материалов и их  распределения в гелях является весьма актуальной задачей, которая может быть успешно решена при использовании телевизионно-вычислительных методов обработки изображений  в сочетании с методами организации баз данных.

Производственный процесс  в автоматизированной ПЦР-лаборатории, который можно условно разделить на следующие составные части:

1. Ввод в ЭВМ данных о пациентах;
2. Создание оптимальной виртуальной модели распределения клинических материалов в гелях для пациентов на текущий день работы лаборатории;
3. Проведение ПЦР и электрофореза в соответствии с виртуальной моделью;
4. Регистрация изображений гелей с люминесцирующими ПЦР - продуктами;
5. Автоматизированная диагностика по телевизионным изображениям гелей;
6. Выдача результатов и их сохранение в базе данных;
7. Сортировка и поиск при анализе работы ПЦР – лаборатории.

На первом этапе в  ЭВМ вводятся основные и дополнительные данные о пациентах на текущий  день работы лаборатории. К основным данным относятся порядковый номер  пациента, его Ф. И. О. ,перечень диагностируемых  инфекций, дата, идентификационный номер пробирки. К дополнительным относятся Ф.И.О. врача, наименование организации и т.п.

Введенная информация в  табличной форме заносится в  базу данных. В массиве исходной таблицы строки содержат информацию, идентифицирующую пациента (порядковый номер пациента, Ф.И.О., идентификационный номер пробирки, наименование организации), а столбцы – информацию о диагностируемых инфекциях.

На втором этапе, исходя из имеющейся  системы ограничений: количества лунок  в геле, номенклатуры тест-систем, номенклатуры диагностируемых инфекций для каждого отдельного пациента и т.п., производится распределение клинических материалов и создание виртуальных моделей гелей. Алгоритм распределения основан на последовательных просмотрах исходного массива таблицы с выбором из него данных по определенным условиям, например, пробы распределяются в порядке убывания их количества для различных типов инфекций. Алгоритм распределения может быть более сложным при необходимости одновременного распределения в геле лунок с, так называемыми, мультиплексными тест-системами, с помощью которых в одну лунку закладывается набор для одновременного тестирования нескольких инфекций.

На третьем этапе  в соответствии с виртуальной  моделью распределяются клинические  материалы в реальных гелях и проводится электрофорез. Соответствие реальных гелей виртуальным моделям является непременным условием для последующей автоматизированной диагностики по их изображениям, поскольку устанавливается взаимно-однозначного соответствие между изображениями люминесцирующих фрагментов и идентификационными данными пациентов.

На четвертом этапе  производится регистрация с помощью  видеосистемы изображений гелей. Изображения  запоминаются в отдельных файлах или специальной базе данных изображений  с именами, соответствующими их виртуальной модели.

На пятом этапе необходимо установить взаимно-однозначное соответствие между изображениями гелей и  идентификационными данными пациентов, содержащимися в базе данных. Взаимосвязи  устанавливаются в процессе диагностики. Последовательность действий врача при автоматизированной диагностике инфекций сводится к следующим операциям:

1. Указывается гель из набора виртуальных моделей;
2. Открывается файл изображения, соответствующий выбранной виртуальной модели;
3. Нумеруются дорожки геля;
4. Производится указание дорожек геля, содержащих положительные пробы;
5. Не указанные дорожки идентифицируются как содержащие отрицательные пробы.

Рассмотренных операций оказывается достаточно, чтобы установить взаимно-однозначное соответствие между разметкой изображения геля, его виртуальной моделью и идентификационными данными пациентов.

На шестом этапе производится выдача результатов для каждого  пациента в отдельности по выбранной  форме, в соответствующие графы  которой заносятся данные пациента и данные диагностики (положительный или отрицательный диагноз).

Результаты диагностики  сохраняются в базе данных, которая  может быть использована при необходимости  для сортировки и поиска по определенным критериям отбора при анализе  деятельности ПЦР - лаборатории за отчетный период. Предлагаемая информационная технология охватывает практически все стадии производственного процесса в ПЦР-лаборатории (прием анализов, подготовку проб, электрофорез, регистрацию результатов электрофореза, диагностику, выдачу заключений, статистическую обработку и подготовку отчетов о работе лаборатории) и позволяет снизить трудозатраты на проведение исследований, уменьшить количество субъективных ошибок, сократить расход реактивов [47].

Рис.10.19. Пример окна для  автоматизированной диагностики по изображениям гелей

 

Программное обеспечение  для анализа изображений продуктов  ПЦР

Программа GEL Explorer [48] предназначена для съемки и анализа изображений гелей с продуктами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и может быть использована для автоматизации процесса исследования полученных проб с целью их идентификации, например, при диагностике инфекционных и наследственных заболеваний методом ПЦР и обеспечивает выполнение следующих функций: