Витамины В12 и В15

Устойчивость

В литературе накопилось много данных об устойчивости витамина B₁₂ к действию как реактивов, так и лекарственных препаратов; многие из этих данных можно теперь истолковать, исходя из строения и реактивности различных частей молекулы витамина. Кристаллический цианкобаламин в твердом состоянии устойчив даже при действии температуры 100° в течение нескольких часов. По Березовскому, при нагревании кристаллического цианкобаламина при 100° происходит медленное разложение. В водных растворах он наиболее устойчив при рН от 4 до 6 (по Березовскому до 7); в этих пределах рН растворы можно стерилизовать автоклавированием при 120° с потерей лишь нескольких процентов активности. При pH 9 происходит быстрое разложение (примерно 90% в сутки).

Аквокобаламин менее устойчив, особенно в щелочном растворе, но оба вещества инактивируются примерно на 90% в течение 1 часа при 100° при рН 8. Нагревание в сильно щелочном растворе использовали для количественного разрушения витамина B₁₂ с целью контроля при некоторых методах микробиологического определения активности. Однако в неочищенных препаратах некоторые восстанавливающие вещества могут оказывать защитное действие. Нейтральные или слегка кислые растворы витамина B₁₂ при комнатной температуре в темноте сохраняются годами, только в очень сильно разведенных растворах идет медленный гидролиз с образованием небольших количеств фактора В. В сильно кислых и, особенно в щелочных растворах при комнатной температуре происходит медленный гидролиз до карбоновых кислот. На свету цианид медленно отщепляется и образуется оксикобаламин, но при выдерживании раствора в темноте происходит обратный процесс. Длительное воздействие солнечного света ведет к необратимому разрушению. Характер действия восстановителей не всегда можно предсказать с уверенностью. Утверждают, что тиоловые соединения в низких концентрациях защищают витамин от разрушения, и их даже используют иногда с этой целью при микробиологических определениях, однако в больших количествах они сами могут вызвать разрушение витамина. Сульфит также рекомендовали применять для защиты Кобаламинов, особенно оксикобаламина. Аскорбиновая кислота действует не так, как другие, восстановители. Она довольно быстро разрушает витамин B_12b, но почти не действует на витамин B₁₂. Данное наблюдение использовали при анализе смесей этих двух веществ, но такой метод пригоден лишь для сравнительно чистых растворов. В печеночных экстрактах содержится защитный фактор, которым оказалось железо; другие металлы, например медь, катализируют реакцию. В сухих лекарственных препаратах витамин B₁₂ устойчив при растирании в порошок с хлористым натрием или с маннитом. Растворы можно стабилизировать фенолом, подвергнутым двойной перегонке, хотя примеси, содержащиеся иногда в феноле, могут вызывать разрушение витамина. Совместное присутствие тиамина (витамина B₁) и никотинамида (или никотиновой кислоты) ведет к медленному разрушению витамина B₁₂ в растворе. Железо защищает витамин В₁₂ от взаимодействия с никотиновой кислотой.

Механизм действия

Недостаток в пище витамина B₁₂ приводит к макроцитарной мегалобластической анемии. Нарушается работа нервной системы, наблюдается резкое снижение кислотности желудочного сока. Впрочем, авитаминоз В₁₂ может развиться даже при полноценном питании, т. к. для процесса всасывания витамина в тонкой кишке обязательно наличие в желудочном соке особого белка – гастромукопротеина (фактор Касла). В полном соответствии с буквальным переводом своего латинского названия, этот белок выделяется стенками желудка, теми же клетками, которые выделяют кислоту. Фактор Касла специфически связывает витамин В12. Точная роль этого фактора не выяснена. Полагают, что в составе комплекса с гастромукопротеином витамин всасывается в тонком кишечнике и поступает в кровь портальной системы в комплексе с транскобаламинами I и II, при этом фактор Касла гидролизуется.

Когда биохимики привыкли к мысли, что витамин В₁₂ не просто специфический антипернициозный фактор, а один из витаминов группы В, они стали предполагать, что он подобно другим водорастворимым витаминам окажется кофактором по крайней мере в одной ферментной системе. Но вопреки ожиданию функции, приписываемые витамину B₁₂ различными исследователями, оказались столь многочисленными и разнообразными, что трудно было представить себе, как все они могли быть связаны с такой ролью кофактора. Поэтому стали искать его основную функцию. Например, казалось вероятным, что он каким-то образом ответствен за поддержание сульфгидрильных соединений в восстановленном реактивном состоянии; он мог бы, скажем, "активировать" различные SH-ферменты, препятствуя их окислению в неактивные S-S-формы. Или если он связан с синтезом белка, он был бы необходим для синтеза белковой части (апофермента) ряда ферментов.

Позднейшие исследования, особенно с применением изотопов, поставили  под сомнение некоторые из приписываемых  витамину В₁₂ функций и выдвинули на первый план другие. Однако ряд новейших результатов еще не подтвержден.

Отношение к сульфгидрильным  ферментам

Влияние концентрата витамина B₁₂ на восстановление некоторых S-S-соединений в SH-форму изучал в o1950 г. Дубнов на ферментных системах in vitro. Он высказал предположение, что восстановлением гомоцистина в гомоцистеин, легко присоединяющий метильную группу, можно, было бы объяснить действие витамина       B₁₂ на синтез метионина. Поддержание глутатиона в восстановленномм состоянии могло бы играть роль в активации SH-ферментов. Эти гипотезы были подкреплены последующими наблюдениями. При рецидивах пернициозной анемии, а также у крыс, получающих рацион с недостатком витамина В₁₂ концентрация сульфгидрильных соединений (главным образ6м глутатиона) в крови ниже нормальной, и в обоих случаях она поднимается до нормы или после введения витамина. Быстрота этой реакции позволяет думать, что это непосредственный результат действия витамина. Однако Жаффе вовсе не обнаружил подобного действия у мышей.

Согласно Лингу и Чоу и  другим авторам, при авитаминозе В₁₂ нарушено использование углеводов. Это могло бы быть связано с низкой концентрацией глутатиона двояким образом. Сульфгидрильные группы некоторых гликолитических ферментов могли бы окисляться до неактивной S-S-формы: в частности, глутатион является простетической группой одного ключевого фермента – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Позднее Дубнов подверг дальнейшей проверке свою гипотезу реактивации SH-ферментов, использовав покоящиеся клетки мутанта Е. coli, нуждающегося в витамине B₁₂. Он нашел, что активность ряда таких ферментов вначале была так же высока, как и в клетках "дикого" штамма, но снижалась по мере старения культур и могла быть вновь повышена добавлением витамина B₁₂ или глутатиона, причем гораздо эффективнее было добавление их обоих.

Обмен жиров и каротина

Благотворное действие витамина В₁₂ на обмен жиров у животных аналогичным образом приписывали поддержанию кофермента А в активном восстановленном состоянии. У крысят, получающих рацион с недостатком витамина B₁₂, организм не способен синтезировать жиры, а у взрослых крыс нарушается использование жиров пищи так что животные становятся тучными в результате избыточного накопления жира. Полагают, что этот эффект лишь частично объясняется, действием витамина B₁₂ на синтез метионина, в результате которого, в свою очередь, увеличивается количество липотропных веществ – холина и бетаина. Установлено, что витамин B₁₂ повышает всасывание каротина или превращение его в витамин А у крыс (на что указывает повышенное накопление последнего в печени); хотя и не влияет на накопление готового витамина А. Механизм этого действия еще неясен.

Участие витамина B₁₂ в биохимических

восстановительных процессах

Утверждали, что витамин В₁₂ помимо действия на сульфгидрильные соединения поддерживает в восстановленном состоянии другие важные вещества. Так, Уилл и сотр. установили, что в плазме больных пернициозной анемией содержание аскорбиновой кислоты понижено; кроме того, при инъекции таким больным аскорбиновой кислоты она быстро окисляется в дегидроаскорбиновую. После лечения витамином B₁₂ эти явления исчезают, а инъекции аскорбиновой кислоты ведут к повышению ее концентрации в плазме. Чоу и сотр. нашли, что в печени крыс с недостаточностью витамина В₁₂ общее содержание дифосфопиридиннуклеотида повышено, но количество его восстановленной формы (ДПН-Н) понижено. Ненормально высокое отношение ДПН/ДПН-Н снижалось вдвое после введения витамина B₁₂.

Было высказано предположение, что витамин B₁₂ способен играть роль восстановителя, когда его трехвалентный кобальт восстановлен до двухвалентного состояния. Однако нужны сильные восстановители, чтобы вызвать эту реакцию, которая в присутствии атмосферного кислорода идет в обратном направлении. Предположение о том, что соединение с белком могло бы сдвинуть окислительно-восстановительный потенциал в область физиологических величин, не вполне убедительно, так как способность связывать белок после восстановления, возможно, утрачивается.

Биосинтез метионина  и серина

Метилкобаламин участвует в  реакциях синтеза метионина в качестве кофактора. Заключительным этапом синтеза метионина у бактерий, грибов, высших растений и животных состоит в переносе метильной группы от СН₃-ТГФК к сульфгидрильной группе гомоцистеина.

Существует два типа ферментов, осуществляющих синтез метионина – первый, независимый от кобаламинов, может использовать в качестве донора метильной группы только триглутаматную форму СН₃-ТГФК. Второй тип ферментов, зависимый от кобаламиновых кофакторов, может использовать как моно-, так и триглутаматную форму СН₃-ТГФК. Для активации ферментов второго типа, кроме того, требуется S-аденозилметионин (S-AdoMet). Последний необходим для первоначального метилирования кобаламина.

Мутант Е. coli, используемый для определения  витамина В₁₂, способен так же хорошо расти и при добавлении к минимальной питательной среде метионина, только для оптимального роста требуется примерно в 10000 раз больше метионина, чем витамина. Очевидный вывод, что в клетках этого организма витамин действует как катализатор синтеза метионина, был подтвержден экспериментально. Однако для любого другого микроорганизма, нуждающегося в витамине B₁₂, этот витамин не может быть заменен метионином, так что он, очевидно, осуществляет у этих организмов какую-то дополнительную функцию.

Таблица 1. Влияние витамина В12 на биосинтез метионина.

Ранние эксперименты с изучением  роста цыплят и крыс также показали, что витамин B₁₂ снижает потребность в метионине, особенно при введении гомоцистеина. Сначала это было истолковано как действие витамина на трансметилирование, т. е. на передачу лабильной метильной группы от холина или бетаина к гомоцистеину с образованием метионина. Точно так же витамин B₁₂ может, по крайней мере частично, заменять холин для цыплят, крыс и поросят-сосунков. Ряд исследований (некоторые из них с использованием ¹⁴С) показал, что витамин B₁₂ не оказывает никакого влияния на трансметилирование, но участвует в прямом синтезе лабильной метильной группы из более окисленных предшественников – таких, как формиат, α-углерод глицина или β-углерод серина. Трудности истолкования результатов, получаемых на интактных животных, хорошо иллюстрирует таблица 1.

При авитаминозе В₁₂ сильно ухудшается аппетит и наблюдаемые результаты часто могут быть обусловлены просто пониженным потреблением пищи по сравнению с контрольными животными. Эту неясность можно устранить, ограничив потребление пищи контрольными животными до уровня, характерного для авитаминозных животных (метод "парного кормления"). Подтверждение данных для поросят и цыплят в опытах с ¹⁴С-формиатом и ¹⁴С-серином получили Джонсон и сотр. Однако при использовании меченого формальдегида результат оказался неожиданным: интенсивность включения метки в метильные группы метионина и холина у цыплят с недостаточностью витамина B₁₂ оказалась значительно повышенной. Есть основательные данные в пользу того, что новообразованные метильные группы появляются в метионине, но потом в результате трансметилирования они могут оказаться в холине или креатине. Эти выводы никто не оспаривал, но некоторые исследования позволяли предположить, что, кроме того, при недостаточности витамина B₁₂ у крыс активность трансметилазы в печени понижена.

Значение витамина B₁₂ в переносе групп с одним атомом углерода почти неразделимо переплетается с функциями фолиевой кислоты (точнее, производных тетрагидрофолевой кислоты). Эти процессы переноса, которые могут происходить на трех различных уровнях окисления, схематически представлены на схеме 2, показаны также связанные с ними реакции окисления и восстановления. Некоторые из этих процессов переноса происходят в несколько этапов (не показанных на схеме 2) это, безусловно, относится к превращению гомоцистина в метионин, и почти нет сомнений, что для реакции в целом необходимы оба витамина. Возможная последовательность этапов показана на схеме 3.

Как уже говорилось, витамину B₁₂ приписывали участие в восстановлении гомоцистина до гомоцистеина – акцептора метильной группы. Однако последующие опыты с мечеными аминокислотами показали, что витамин, возможно, не нужен для этого восстановления. Какое-то производное фолиевой кислоты, несомненно, участвует в самом переносе радикала с одним углеродным атомом. Тогда единственная функция, остающаяся для витамина B₁₂, состоит в восстановлении этой группы в метильную группу метионина – если только витамин не действует лишь косвенным образом, способствуя, например, синтезу ферментов. Во всяком случае, синтез метионина не может быть единственной биохимической функцией витамина В₁₂ у высших животных, так они гибнут от его недостаточности даже при большом количестве метионина и холина в пище.

Сопоставление данных, приводимых в  пользу и против участия витамина B₁₂ во взаимопревращениях глицина и серина, приводило скорее к выводу об отсутствии влияния витамина, но работа Вора и сотр. вскрыла новую сторону проблемы. Эти авторы не обнаружили снижения общего синтеза серина из α-¹⁴С-гли-цина в срезах печени индейки, но наблюдали значительное уменьшение включения ¹⁴С в положении 3. Они объясняют это тем, что витамин B₁₂ действует на этапе отщепления от глицина радикала с одним углеродным атомом, перенос которого осуществляет тетрагидрофолевая кислота. Если это подтвердится, то, по-видимому, такой же механизм мог бы действовать в синтезе метильной группы метионина de novo.