Витамины В12 и В15

Диолдегидратаза представляет собой  белок с мол. массой 250000 с единственным активным центром содержащим аденозилкобаламин. Хроматография позволяет разделить фермент на две субъединицы с разными молекулярными массами. Каждая из субъединиц неактивна, рекомбинация их приводит к восстановлению активности. Весьма важным и, по-видимому, общим свойством всех аденозилкобаламин-ферментов, является чувствительность диолдегидратазы к сульфгидрильным ингибиторам. Образование тройного ферментного комплекса   (апофермент-АденозилКобаламин-пропандиол-1,2)    полностью защищает фермент от действия ртутьсодержащих ингибиторов. Это позволяет утверждать, что HS-группа (или группы) фермента может иметь большое значение для проявления биокаталитической активности. Важно подчеркнуть, что защищающим действием, помимо аденозилкобаламина, обладают и другие Кобаламины (CN-Кобаламин, метилкобаламин), введение которых в ферментный комплекс вместо кофермента приводит к его инактивации. Тем не менее расщепление такого комплекса после обработки SH-соединением и последующая реконструкция с аденозилкобаламином вновь восстанавливает активность. Изучение химической модификации этого фермента выявило большое значение различных аминокислотных остатков в активном центре фермента. Так оказалось, что один остаток аргинина на моль фермента является необходимым для проявления каталитической активности диолдегидратазы. Наконец, недавно было продемонстрировано значение другой основной аминокислоты – лизина для проявления ферментативной активности. Остаток лизина, важный для обеспечения активной олигомерной структуры фермента и связывания аденозилкобаламина, локализован в низкомолекулярной субъединице. Остатки основных аминокислот обеспечивают ионное взаимодействие между субъединицами.

 

Глицеролдегидратаза

 

Другой фермент, катализирующий превращения  вицинальных гликолей в альдегиды  – глицеролдегидратаза или глицеролгидролиаза ответственен за изомеризацию глицерина в β-оксипропионовый альдегид и продуцируется как некоторыми штаммами Klebsiella р., так и Propionibactereciae. Кофакторами, необходимыми для проявления активности глицеролдегидратазы, являются аденозилкобаламин и К⁺. Очистка фермента из Кl. р. привела к выделению ферментного комплекса с мол. массой 188000, содержащего две субъединицы разного размера и 1 моль аденозилкобаламина на 1 моль фермента. Меньшая субъединица с мол. массой 22 000 в свою очередь распадается на два белка с мол. массой около 12 000. Самосборка субъединиц в ферментном комплексе промотируется субстратом – глицерином, аденозилкобаламином и ионом К⁺. Интересно, что ион Na⁺ ингибирует активность фермента и ни одна из субъединиц по отдельности не способна связывать аденозилкобаламин.

Аналогично диолдегидратазе, глицеролдегидратаза  ингибируется сульфгидрильными ингибиторами, причем в опытах с обработкой субъединиц и последующей сборкой было показано, что меньшая субъединица после обработки еще сохраняет 25% от первоначальной активности, в то время как большая полностью ее теряет.

 

Этаноламин-аммиак-лиаза

 

Фермент, осуществляющий превращение  этаноламина в ацетальдегид и  аммиак – этаноламин-аммиак-лиаза  – был описан в 1965 г., очищен и выделен в гомогенном состоянии в 1968 г.

Этот аденозилкобаламин-фермент  интенсивно исследовался в работах  Бэбиора и Ейбилиса. Итоги изучения фермента можно суммировать следующим  образом: оказалось, что, в отличие  от диолдегидратазы, единственным субстратом этаноламин-аммиак-лиазы является этаноламин. Позднее было выяснено, что L-2-аминопропанол также может превращаться в пропионовый альдегид и аммиак. Однако это превращение сопровождается необратимым расщеплением кофермента. При реакции NH₂-гpyппa всегда перемещается от С2 к С1 (т. е. к атому, с которым связана ОН-группа). В опытах с меченым ¹⁸О Н₂О было показано, что гидроксил при С1 всегда остается в продукте. Тем самым был исключен механизм образования ацетальдегида через промежуточный имин, гидролиз которого обязательно привел бы к включению метки в продукт. Наблюдаемый во всех аденозилкобаламин-зависимых реакциях перенос водорода С1→С2 был обнаружен и в этой реакции. Опыты с энантиомерами многократно меченого субстрата - 2-амино-[2²H, 2³Н]-этанола свидетельствовали о рацемизации продукта (ацетальдегида). Несмотря на то, что прямых доказательств перемещения NH₂-группы от С2 к С1 не было получено, процесс превращения этаноламина в ацетальдегид и аммиак описывается по аналогии с другими реакциями.

Фермент представляет собой довольно большой белок с мол. массой 520000. В пятимолярном растворе гуанидин-НСl он диссоциирует – на субъединицы с мол. массой 50000. Показано, что фермент содержит два независимых активных центра. Подобно диолдегидратазе фермент активируется одновалентными катионами К⁺ и NH₄⁺ и ингибируется сульфгидрильными ингибиторами.

 

Аденозилкобаламин-зависимые  мутазы

 

Следующую группу Аденозилкобаламин-ферментов, составляют мутазы, катализирующие перегруппировки  углеродного скелета и приводящие к обратимым превращениям субстратов с разветвленной цепью в соединения с прямой цепью. Среди этих ферментов хорошо изучены два – глутаматмутаза и метилмалонил-СоА-мутаза.

 

Глутаматмутаза

 

Фермент, катализирующий превращение  L-глутамата в L-трео-β-метиласпартат, был выделен, из Clostridium tetanomorphum. Показано, что многочисленные фотосинтезирующие микроорганизмы также содержат глутаматмутазу. Фермент, кроме аденозилкобаламина, нуждается в SH-соединении, однако, в отличие от диолдегидратаз и других аналогичных ферментов, для проявления каталитической активности не требуются одновалентные катионы. Фермент высокоспецифичен в отношении структуры субстратов. Ни аналоги глутаминовой кислоты, ни аналоги β-метиласпарагиновой кислоты (как, например, β-этиласпартат) не являются субстратами мутазы.

Опыты по очистке фермента позволили  установить субъединичную структуру  и этого аденозилкобаламин-зависимого фермента. Были получены в гомогенном состоянии две субъединицы, которые  были названы S- и Е-белками. Каждый из белков не обладал порознь активностью. Рекомбинация их и взаимодействие с коферментом приводили к восстановлению активности. Первым был очищен Е-белок. Определение молекулярного веса показало, что это довольно большой белок с мол. массой около 128 000. В отличие от ферментов, рассмотренных выше, добавление Кобаламина не защищало Е-компонент глутаматмутазы от инактивации в растворе. Е-компонент связывал 1 моль аденозилкобаламина, а в присутствии семикратного избытка S-компонента дополнительно связывал еще один моль кофермента.

Компонент S после очистки, как оказалось, обладал намного меньшей мол. массой 17000 и, по-видимому, содержал важные для проявления ферментативной активности SH- группы. Титрование S-белка сульфгидрильными реагентами показало, что на 1 моль белка приходится пять SH-групп. Примечательной особенностью компонента была его способность к димеризации в присутствии О₂. Расщепление димера осуществлялось обработкой последнего каким-либо RSH-соединением. Это свидетельствовало об образовании межмолекулярного дисульфидного мостика. Инактивация S-белка с помощью AsO₂^- доказывала наличие в активном центре по крайней мере одной из двух вицинальных тиольных групп. Превращение SH-групп S-белка представлены на схеме 3.

 

Метилмалонил-СоА-мутаза

 

Другой аденозилкобаламин-зависимый  фермент, осуществляющий перегруппировку  углеродного скелета метилмалонил-СоА  в сукцинил-СоА был также сначала  выделен из микроорганизмов, а затем  из тканей млекопитающих. Оказалось, что  этот кобаламин-зависимый фермент  выполняет метаболически важную роль на пути превращения пропионил-СоА в сукцинил-СоА. Схема этого участка метаболизма включает 3 фермента: биотин-зависимую карбоксилазу, рацемазу, превращающую D-метилмалонил-СоА в L-изомер и рассматриваемую кобаламин-мутазу. После очистки метилмалонил-СоА-мутазы оказалось, что это субъединичный фермент с мол. массой 124000, расщепляющийся на два компонента с мол. массой 61 000 и 63000. Выделенная из печени овцы метилмалонил-СоА-мутаза представляет собой окрашеный в оранжевый цвет белок с мол. массой 165000. Фермент связывал 1 моль аденозилкобаламин на 75000.

2-метиленглутаратмутаза

 

Следующий сходный по действию Аденозилкобаламин-зависимый фермент-это 2-метиленглутаратмутаза, катализирующая обратимое превращение между 2-метиленглутаратом и 2-метилен-З-метилсукцинатом. Фермент был выделен из микробиологических источников при выращивании Clostridium на средах, содержащих никотиновую кислоту. Определение молекулярной массы частично очищенного препарата дало величину 170000. Обработка йодацетатом приводит к потере активности, что, очевидно, свидетельствует о наличии важных для катализа SH-групп. Действие AsО₂^-, однако, не выявило присутствия вицинальных дитиольных групп.

                                        

Ферменты, трансформирующие α, ω-диаминокислоты

 

Еще одна группа аденозилкобаламин-зависимых  ферментов была выявлена при исследовании микроорганизмов, растущих на L-лизине. Эти ферменты катализировали перенос NH₂-гpyппы от концевого углеродного атома в диаминокислотах к соседнему атому углерода. Недавно описан аденозилкобаламин-зависимый фермент, который осуществляет перенос NH₂-группы из α- в β-положение аминокислоты лейцина.

Рассмотрим более подробно аденозилкобаламин-зависимые  ферменты, трансформирующие α, ω-диаминокислоты. Эти ферменты выделены из различных штаммов Clostridium.

Важно, что все три фермента в  высшей степени специфичны для каждого  из субстратов. Замена субстрата для  данного фермента на субстраты других аминомутаз не позволяет осуществлять перенос аминогруппы.

D-α-Лизинмутаза выделена из С. sticklandi, мол. масса 250000. В процессе  очистки фермента не происходило  отщепления аденозилкобаламина, что  свидетельствует о большой прочности  связи комплекса апофермент-кофермент.  Аналогично от L-β-лизинмутазы в  процессе очистки аденозилкобаламин также не отделялся. Это тетрамерный фермент с мол. массой 160000; его субъединичная структура была подтверждена после того, как удалось выделить компоненты с мол. массой 32000 и 52000. Оказалось, что для обеспечения нормальной каталитической активности обеих мутаз необходим белок с мол. массой 60000. Как видно, аминомутазы сохраняют способность защищать в полностью реконструированном виде важные для биокатализа SH-группы. Это свойство характерно для большинства Аденозилкобаламин-ферментов.

Орнитинмутаза также представляет собой фермент с прочно связанным  аденозилкобаламином, который не отщепляется  при очистке. Очищенный фермент  имел мол. массу 170 000 и диссоциировал  на две субъединицы с мол. массой 90000. Этот фермент не требовал для своей активации какого-либо SH-белка, однако сам содержал важные для биокатализа SH-группы, вследствие чего ингибировался под действием тиоловых ингибиторов.

Заслуживает особого внимания прочность, с которой связан аденозилкобаламин  во всех трех ферментах. При обработке их внутренним фактором ферменты инактивировались. Сравнительное исследование трех аминомутаз показало, что в дополнение к аденозилкобаламину для проявления их активности требуются: для D-α- и L-β-мутаз ионы Mg²⁺ и одновалентные катионы, причем для D-α-лизинмутазы-это К⁺, Rb⁺ и NH₄⁺ (фермент ингибируется при добавлении Na⁺ и Li⁺). L-β-лизин-мутаза в разной степени активна в присутствии Li⁺, Na⁺, К⁺, Rb⁺, Cs⁺ и. NH₄⁺. Для проявления активности орнитинмутазы добавления ионов металлов вообще не требуется.

Поразительное отличие аминомутаз от всех остальных кобаламин-зависимых  ферментов состоит в том, что  вторым обязательным коферментом для  них является пиридоксальфосфат, который  обеспечивает перенос ω-NH₄-гpyппы в форме пиридоксамина или пиридоксальдимина. Очищенная орнитинмутаза неактивна до тех пор, пока к реакционной смеси не будет добавлен пиридоксальфосфат (PLP). Очевидно, что PLP входит в активный центр фермента и, по-видимому, связан в виде основания. Шиффа с ε-NН₄-группой остатка лизина белка.

 

Рибонуклеотидредуктаза

 

Рибонуклеотидредуктаза - фермент, катализирующий конверсию рибонуклеотидов в 2`-дeзoкcиpибoнyклeoтиды. Этот фермент, имеющий ключевое значение для биосинтеза ДНК у большинства  живых организмов, представляет собой  железо-протеиновый комплекс, не зависящий от корриноидов. Однако ряд микроорганизмов и различные Euglenophyt содержат рибонуклеотидредуктазу, коферментом которой является аденозилкобаламин. Оказалось, что фермент состоит из одной полипептидной цепи с мол. массой 76000. Субстратом для рибонуклеотидредуктазы являются рибонуклеозидтрифосфаты. Для очищенной рибонуклеотидредуктазы необходимыми кофакторами, кроме аденозилкобаламина, являются тиолы.

 

 

 

 

 

Витамин В₁₅

 

Получение и аналоги  витамина В₁₅

 

Впервые, как уже было упомянуто во введении, витамин В₁₅ был обнаружен в экстракте печени быка.

Пангамовая кислота представляет собой эфир D-глюконовой кислоты и диметилглицина с молекулярной массой 281.

(СH₃)₂NCH₂COOCH₂(HCOH)₄COOH

Получают пангамовую кислоту  следующими двумя способами:

1. Взаимодействием D-глюконолактона с монохлоруксусной кислотой и последующей обработкой продуктов реакции диметиламином.
2. Этерификацией глюконовой кислоты с диметилглицином. (выход около 25%)

Пространственное строение молекулы витамина В₁₅ изображено на рис. 9 (Приведено строение пангамата кальция, соли, применяющейся в терапевтических целях)

Аналогами витамина В₁₅ можно считать ряд соединений, представленных на рис. 10, так как во всех этих соединениях метильная группа лабильна, что и обуславливает биохимические свойства витамина В₁₅.

 

Механизм действия

 

Потребность в витамине В₁₅ (по Кребсу, данные от 1951 г.) составляет менее двух мг. в сутки. Однако принадлежность пангамовой кислоты к витаминам не доказана, в частности не существует достоверных сведений об авитаминозах или гипервитаминозах, связанных с этим соединением. Предпринимались попытки определить токсичность пангамовой кислоты в связи с ее широким применением в терапии. Выяснилось, что токсическая доза для витамина В₁₅ приблизительно в 100000 раз превышает терапевтическую, т. е. вещество, фактически, безвредно.