Влияние пролактолиберина на социальное взаимодействие белых крыс

Гипоталамические пептидные гормоны регулируют секрецию большинства гипофизарных гормонов: гормона роста, фолликуло-стимулирующего гормона, лютинизирующего гормона, тироидно-стимулирующего гормона и адренокортикотропина. Однако, считается что эти пептиды не регулируют секрецию пролактина. Пептиды действуют через определенные рецепторы (с семью трансмембранными доменами или соединенные с G-белком рецепторы). Хотя пролактин активно выделяется во время лактации и последнего триместра беременности, участвует в процессе синтеза молока, стимулирующий высвобождение пролактина гормон долгое время оставался неизвестным. Был обнаружен рецептор, hGR3, локализованный в гипофизе человека. Позднее был найден лиганд hGR3 в гипоталамусе и идентифицирован новый пептид. Было показано, что этот лиганд - мощный высвобождающий пролактин фактор клеток передней доли гипофиза  для крыс, он получил название пролактин-релизинг фактор. (Hinuma et al.1998).

Пролактолиберин (ПрРГ) был впервые идентифицирован как лиганд к рецептору GPR10/hGR3, рилизинг-фактор пролактина. ПрРГ, как известно, стимулирует выработку пролактина как в искусственных, так и в естественных условиях. Было показано, что клетки продуцирующие пролактолиберин находятся в дорсомедиальном гипоталамическом ядре и в вентролатеральной области ретикулярной формации, а также в районе ядра солитарного тракта продолговатого мозга. Аксоны нейронов, вырабатывающих пролактолиберин, направляются в паравентикулярное ядро гипоталамуса к нейросекреторным клеткам (с рецепторами к ПрРГ), где образуют с ними синаптические контакты. Эти данные указывают на то, что пролактолиберин играет важную биологическую роль в нейроэндокринной системе. Было доказано, что пролактолиберин значительно увеличивает секрецию окситоцина и вазопрессина  нейросекреторными клетками гипоталамуса. Кроме того, обнаружено, что выделение пролактолиберина  стимулирует выработку адренокортикотропина и ß-эндорфина через секрецию кортикотропин высвобождающего гормона из клеток гипоталамуса (Maruyama et al.2001).

При центральном введении крысам пролактолиберин снижает потребление пищи и, как следствие, вес тела, модифицирует температуру тела, предполагают, что он играет роль в регуляции энергетического гомеостаза. Однако медиаторы (промежуточные компоненты) действия ПрРГ не известны. Существуют эксперименты по изучению возможного участия анорексических нейропептидов кортиколиберина и меланокортинов (меланоцит-стимулирующий гормон) в воздействии ПрРГ  на потребление пищи и температуру тела; а также определялось, может ли  влиять данный гормон на расходование энергии посредством изменения потребления кислорода (Lawrence et al.2003). Внутрижелудочковое введение ПрРГ (4 нмоль) самцу крысы Sprague-Dawley после 24-часового голодания снизило потребление пищи и изменило температуру тела. Блокирование центральных кортиколибериновых рецепторов путем внутрижелудочкого введения антагониста рецептора астрессина (20 г) отменяет вызванное ПрРГ снижение потребления пищи (пищевое поведение стабилизируется). Однако воздействие астрессина на вызванные ПрРГ изменениия температуры тела сложнее для понимания, поскольку сам астрессин вызывает небольшой подъем температуры. С другой стороны, внутрижелудочковое введение антагониста SHU-9119 к рецептору меланокортина не влияло на действие ПрРГ. (Lawrence et al.2003)

 Отмечалось, что внутрижелудочковое введение пролактолиберина  вызвало значительно большее потребление кислорода, в течение 3 часового теста в сравнении с подвижными крысами.

 Эти результаты свидетельствуют  о том, что анорексический эффект пролактолиберина опосредован  кортиколибериновыми рецепторами, но не рецепторами меланокортина, также пролактолиберин может изменять количество потребляемого кислорода (Lawrence et al.2003).

Опыты с парным кормлением позволили  предположить, что снижение веса после  введения пролактолиберина происходит не только из-за его анорексического воздействия, подразумевается, что ПрРГ может иметь дополнительные эффекты, возможно на расходование энергии. В пользу этой идеи свидетельствует то, что ПрРГ влияет на температуру тела и наблюдается характерное повышение температуры через 2-8 часов после внутрижелудочкового введения. Однако, повышение температуры – это только индикатор того, что ПрРГ повышает расход энергии и должны быть получены более точные данные, основанные на потреблении кислорода (Lawrence et al.2003)

Механизм воздействия пролактолиберина на аппетит и температуру тела не известен. Маловероятно, что сам  пролактин является медиатором, поскольку несколько групп исследователей показали, что ПрРГ не вызывает, или очень слабо действует на высвобождение пролактина in vivo и in vitro. Один из возможных посредников – это кортиколиберин. Также как и в случае с пролактолиберином центральное введение кортиколиберина вызывает снижение аппетита и массы тела и изменяет скорость движений у грызунов. Считается, что иммунореактивные нити ПрРГ образуют синаптические контакты с кортиколиберин-содержащими клетками паравентикулярного ядра гипоталамуса у крыс, таким образом обеспечивая морфологическое доказательство в пользу взаимодействия этих нейропептидов. Более того, внутрижелудочковое введение ПрРГ повышает нейрональную активность в паравентикулярном ядре гипоталамуса у крыс, включая 80% кортиколиберин-содержащих нейронов, а in vitro пролактолиберин повышает секрецию кортиколиберина в гипоталамусе. Также  введение ПрРГ у крыс стимулирует повышение уровня адренокортикотропного гормона в плазме, что зависит от активации кортиколибериновых рецепторов и кортикостерона (Seal at al.2002).

Итак, предполагают, что воздействие пролактолиберина на энергетический баланс опосредовано рецепторами кортиколиберина. Главной целью некоторых исследований, было проверить гипотезу, что центральные кортиколибериновые-рецепторы опосредуют эффект пролактолиберина на потребление пищи и температуру тела. Другое исследуемое направление – меланокортиновая система: было рассмотрено, что она частично опосредует воздействие модуляторов, таких как лептин, а сильные воздействия пролактолиберина и лептина очень похожи. К тому же, эффект пролактолиберина на метаболизм был проверен более точно путем измерения количества потребляемого кислорода закрытым калориметрическим методом (Lawrence et al.2003).

Таким образом, в настоящее время выявлен только один явный психотропный эффект пролактолиберина, а именно – торможение пищевого поведения.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.МЕТОДИКА

 

Опыты проводили  на самцах крыс линии Вистар (n=30) со средней массой 320±4 г в возрасте 2 месяца в начале эксперимента. Животных содержали в стандартных условиях при свободном доступе к пище (сухой комбикорм для грызунов) и воде, по 5 особей в клетке. Перед началом экспериментом животных в течение 14 дней ежедневно по 5 мин подвергали  процедуре хэндлинга, для предотвращения стрессорной реакции на взятие в руки в период проведения экспериментов (Вигаш, 1990).

Для оценки тревожности  животных тестировали в приподнятом  крестообразном лабиринте (ПКЛ). Тревожность, определяемая по данной методике, отражает естественный страх высоты и открытых пространств у грызунов. Уровень тревожности определяется обратно пропорционально времени, проводимому в открытых рукавах (Pellow et al., 1985).

ПКЛ состоит из двух открытых рукавов,  длиной 50см, шириной 10см, а также двух закрытых рукавов длиной 50см, шириной 10см и высотой не менее 40см. Размеры входов в открытые рукава 10x10см. Они расположены друг напротив друга на расстоянии 10см. Пол каждого из рукавов расчерчен на квадраты 10х10см. ПКЛ располагается на высоте не менее 75см над полом (рис 1.).

ПКЛ был установлен так, чтобы крысы, находясь на каждом из открытых рукавов, видели одно и  тоже. Кроме того, расстояние от края открытого рукава до ближайшего предмета (включая стену) было более 0,5м, чтобы  избежать ненужных таксисов.

Животное помещали в центр ПКЛ головой к открытому рукаву. Всех животных сажали головой в одну и ту же сторону.  Время тестирования 5 минут.  Регистрировали время пребывания в открытых рукавах ПКЛ и время, в течение которого животное находится в движении; количество вертикальных стоек, заходов в рукава лабиринта и пересеченных квадратов, а также, число и длительность реакций груминга, свешивания с открытых рукавов ПКЛ, болюсы.

Время тестирования составляло 5 минут. После тестирования каждой крысы, лабиринт протирали раствором перекиси водорода для уничтожения запаха предыдущего животного. Тестирование проводили с15 до 17 часов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.1. Приподнятый крестообразный лабиринт.

 

1 – открытые рукава, 2 – закрытые  рукава, 3 – центр.

 

Через неделю после тестирования в  ПКЛ, поведение животных исследовали в тесте предпочтения. Ранее данный тест применялся для оценки процептивности самок.

На ограниченном стенками (высота 35 см) квадратном поле (90х90х70 см) в противоположных углах размещали маленькие клетки, в которых помещали крыс (рис.2). Клетки были изготовлены из пластмассовых решёток (18х18х18 см), что обеспечивало в ходе эксперимента визуальный, обонятельный и тактильный контакт между животными, но предотвращало агонистические взаимодействия.

 Исследуемых животных делили  на две группы. Первой группе вводили пролактолиберин по 10 мкл (конц.10^-10мкмоль) в каждую ноздрю (20 мкл на крысу) за 15 мин до теста. Второй группе, контрольным животным, вводили дистиллированную воду (20 мкл на крысу). В одну клетку помещали крысу «чужака» - животное, которое ранее ни разу не имело никаких социальных контактов с исследуемым животным, в другую, крысу из той же жилой клетки, что и тестируемое животное. Исследование проводили в светлое время суток с 13 до 16 ч., длительность эксперимента -  5 минут. Тестируемое животное помещали в центр поля. Учитывалось время нахождения крысы на площади рядом с каждой из клеток (10% от общей свободной площади) и на нейтральном пространстве (80%).

Одним из специфических способов введения лекарственных препаратов является их распыление в носовой полости. Он основан на способности ряда лекарственных веществ, всасываться в слизистой оболочке носовой полости и поступать в системный кровоток (Гуревич,  2002). Использование данного способа введения имеет ряд преимуществ по сравнению с системным или внутрижелудочковым введением.

Основными преимуществами интраназального  применения веществ являются:

• наличие центрального действия веществ (за счет того, что оболочки обонятельных нервов лишены гематоэнцефалического барьера, вещества из носовой полости могут сразу же поступать в головной мозг)
• высокая биодоступность
• отсутствие эффекта первого прохождения через печень и связанные с этим неблагоприятные реакции
• атравматичность
• отсутствие системного эффекта
• малые дозы вещества

Двухстороннее введение применялось вследствие того, что в настоящее время показана асимметрия распределения рецепторов ко многим нейропептидам как в коре больших полушарий, так и в подкорковых образованиях.

Статистическая обработка проводилась  с использованием двухстороннего двухфакторного дисперсионного анализа в программе Excel и Statistica.

 

 

 

 

   

Рис 2.  Внешний вид установки для выявления социального предпочтения

1. Пластмассовые клетки с  крысами -  «чужаком» и «своим».
2. Территория вокруг клетки, нахождение в которой оценивалось как пребывание рядом с представителем своего вида.
3. Нейтральное пространство

 

 

 

3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

 

Для разделения животных по уровню тревожности на группы, использовался тест - приподнятый крестообразный лабиринт.

Тревожность оценивалась по величине обратно пропорциональной времени  проведенному, в открытых рукавах. Распределение  животных по уровню тревожности отображено на рис.3

К низкотревожным были отнесены крысы, которые проводили в открытых рукавах более 100 секунд (до 33% времени тестирования, n =13), к высокотревожным – менее 70 секунд (до 23%, n=11). Остальные животные по времени пребывания в открытых рукавах от 70 (23%) до 100 (33%) секунд составили группу среднетревожных особей (n=6).

Во второй, основной части эксперимента, проводили исследование поведения  животных в тесте предпочтения знакомого  или незнакомого конспецифика (представитель своего вида). Срок, проведённый исследуемым животным у клетки со «своим» или «чужим» являлось критерием социального предпочтения. Поскольку социальный состав группы не изменялся длительное время (в течение 2 месяцев), таким образом, в группе сложились стабильные социальные отношения.

 Крыс разделили на две группы: в первую опытную группу входили животные, которым вводили гормон (пролактолиберин), животным второй группы  - дистиллированную воду (контроль).

Анализ поведения животных в  период тестирования показал: несмотря на то, что нейтральная площадь составляет 80%  от общей территории, крысы большую часть времени проводили на зоне рядом с клеткой, в которой находился конспецифик (районы рядом с конспецификом занимают 20 % от совокупной территории).

Таким образом, время, проведённое  животными с введённым гормоном, не отличалось от времени проведённого  животными контрольной группы - и те и другие достоверно больше времени находились рядом с конспецификом, а не на нейтральной территории (рис.4). Результаты эксперимента приведены в таблице 1.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 3 - Распределение животных по уровню тревожности.

Каждая точка – данные по одному животному, по вертикали -  время, проведенное  каждым из животных в открытых рукавах  (секунды).