Биотрансформация иммобилизованными ферментами

3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты.

4. Синтез L-яблочяой кислоты из фумаровой кислоты.

5. Получение диетического  безлактозного молока.

6. Получение cахаров из молочной сыворотки.

Получение глюкозо-фруктозных спиртов

Фруктоза, или иначе  фруктовый, плодовый или медовый  сахар, широко распространена в природе. Этот особый сахар содержится во многих фруктах и плодах. Особенно богаты им яблоки и помидоры, а также пчелиный мед, который почти наполовину состоит из фруктозы. По сравнению с обычным сахаром (в состав молекул которого фруктоза также входит, но в виде химического соединения с менее сладкой глюкозой) фруктоза обладает более приятным вкусом, и, согласно профессиональной терминологии, вкус фруктозы «медовый», а обычного сахара—«приторный». Далее, по сладости фруктоза на 60-70% слаще сахара, и соответственно ее меньшее потребление влечет за собой меньшую калорийность продукта. Это важно с точки зрения диетологии питания. Наконец, фруктозу в отличие от глюкозы или сахара могут потреблять больные диабетом, и вообще замена сахара фруктозой существенно снижает вероятность этого заболевания. Дело в том, что физиологический путь использования человеческим организмом фруктозы совершенно другой, чем сахара или глюкозы, и не связан с превращением инсулина. К этому остается добавить, что фруктоза значительно менее вредна для зубов (из-за кариеса), чем сахар, и в смеси с глюкозой не кристаллизуется (не засахаривается), что важно в производстве мороженого, кондитерских изделий и т. д.

Несмотря на все эти неоспоримые  преимущества фруктозы по сравнению  с обычным сахаром, ее производство в мире практически отсутствовало вплоть до начала 70-х годов. Однако после того как в 1973 г. американской компанией «Клинтон Корн» был внедрен в промышленность процесс превращения глюкозы во фруктозу под действием иммобилизованного фермента глюкозоизомеразы, этот процесс стал самым крупным в мире по сравнению с другими, в которых используются иммобилизованные ферменты.

Научные основы процесса довольно просты. Фермент глюкозо-изомераза-катализирует превращение (изомеризацию) глюкозы  во фруктозу в одну стадию, и реакция протекает до тех пор, пока в реакционной системе количества глюкозы и фруктозы не станут приблизительно равными. После этого реакция останавливается, и полученную смесь можно либо использовать в виде глкжозо-фруктозного сиропа, либо отделить фруктозу и оставшуюся глюкозу опять подвергнуть изомеризации. Этот процесс проводят непрерывно в реакционных колоннах высотой до 5 м, - которые предварительно заполняют иммобилизованным ферментом в виде гранул, полых нитей, кусочков геля (типа желатины) и т. д. В колонну непрерывным потоком подают раствор глюкозы (предварительно полученной при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала), из колонны вытекает глюкобзо-фруктозный сироп.

Об эффективности такой  технологии свидетельствуют следующие данные: на 1 кг иммобилизованного фермента за 100 дней работы получается 4 т фруктозы (в пересчете на сухой продукт) [4]. При этом время, за которое активность фермента уменьшается вдвое (так называемое время полуинактивации фермента) составляет от 20 до 50 дней. Иначе говоря, катализатор (иммобилизованный фермент) в колонне следует заменять только раз в 2 или даже 3 мес и процесс благодаря этому становится экономически выгодным, особенно по сравнению с использованием растворимой глюкозоизомеразы. Расчеты показывают, что в последнем случае затраты на фермент в 10 раз выше, и трудозатраты выше в 3 раза. В целом стоимость процесса с иммобиллизованным ферментом составляет лишь 61% от стоимости процесса с растворимым ферментом [4].

Современный завод по производству глюкозо-фруктозных сиропов с помощью иммобилизованного фермента, которых в мире имеется уже несколько десятков, производит до 400 т продукта в день в пересчете на сухое вещество: В целом мировое производство глюкозо-фруктозных сиропов в 1980 г. достигло 2,5 млн. т и, по оценкам, составит около 4 млн. т в 1985 г. и Свыше 5 млн. т в 1990 г. В США уже в 1998 г. потребление населением фруктозы составило 12%   от  потребления сахара  и ожидается дальнейший рост вплоть до 30—40% к 2000 г. В Японии уже к 1985—1990 г,. около 30% потребляемого в стране сахара будет заменено на глюкозо-фруктозную смесь и чистую фруктозу [4].

9.2. Получение аминокислот

Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать все  нужные им аминокислоты из более простых химических соединений. Однако человеческий организм способен синтезировать лишь 12 из 20 так называемых «магических» аминокислот, необходимых ему для жизнедеятельности. Остальные 8 аминокислот получили название незаменимых и должны поступать в организм извне - с пищей. При нехватке хотя бы одной из незаменимых аминокислот замедляется рост организма, начинаются болезни. Поэтому важно производить эти аминокислоты для корректировки рационов питания, в лечебных и профилактических целях и т. д.

Производство многих аминокислот, в том числе и  незаменимых крупнотоннажная отрасль химической промышленности. Однако химики производят смесь оптических изомеров аминокислот, иначе говоря, смесь L- и D-аминокислот, молекулы которых в L- и D-форме представляют собой зеркальные отражения друг друга. В химических реакциях эти изомеры практически неразличимы, более того, по многим химическим критериям смесь L- и D-изомеров аминокислот представляет собой «химически чистое» вещество. Однако в большинстве случаев (исключением является лишь метионин) человеческий организм усваивает лишь L-аминокислоты, а их D-изомеры являются нежелательной примесью.

Разделение смеси  L- и D-аминокислот, так называемой рацемической смеси, на составляющие ее изомеры стало первым процессом в мире, осуществленным с помощью иммобилизованных ферментов на промышленном уровне. Этот процесс был реализован в Японии компанией «Танабе Сейяку» в 1969 г. В течение 15 предшествующих лет данный процесс проводился компанией с применением растворимого фермента—аминоацилазы, но он был недостаточно экономичен. После перевода на иммобилизованную аминоацилазу экономическая эффективность процесса возросла в полтора раза, и в настоящее время компания осуществляет на промышленном уровне производство пяти L-аминокислот, из них четыре незаменимые (метионин, валин, фенилаланин, триптофан).

В качестве исходного  вещества используются ацилированные L- и D-аминокислоты, полученные с помощью обычного химического синтеза, и их подвергают воздействию аминоацилазы. Фермент гидролизует только ацил-L-изомер, отщепляя от него объемную аыильную группу и тем самым резко увеличивая растворимость образующейся L-аминокислоты по сравнению с присутствующим в реакционной системе ацил-D-изомером. После этого вещества легко отделяются друг от друга с помощью известных физико-химических приемов, продуктом является чистая L-аминокислота.

Остающаяся ацил-D-аминокислота при нагревании рацемизуется, т. е. переходит опять в смесь ацилированных L- и D-аминокислот, и процесс повторяют сначала. Таким образом, в итоге единственным продуктом является L-аминокислота. Оказалось, что для аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь строение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфичность. Благодаря этому одна и та же реакционная колонна с иммобилизованной аминоацилазой может быть использована для производства самых различных, L-аминокислот.

Иммобилизованный фермент  легко готовить, так как он просто адсорбируется на специальной смоле, которую затем помещают в колонну  объемом 1 м³. Время полуинактдвации иммобилизованного фермента в промышленных условиях составляет 65 дней, и, когда активность катализатора падает ниже нормы (раз в несколько месяцев), в колонну добавляют раствор свежего фермента, который опять адсорбируется на носителе. Устойчивость полимерного носителя для иммобилизации фермента столь высока, что он используется японской компанией более 8 лет в той же колонне без замены.

9.3. Получение L-аспарагиновой кислоты

Аспарагиновая кислота  не принадлежит к числу незаменимых, но производится в мире многими тысячами тонн. Она находит широкое применение в пищевой промышленности для придания (в сочетании с другой аминокислотой—глицином) кондитерским изделиям и напиткам различных оттенков кислого или сладкого вкуса.

Замечателен процесс  получения аспарагиновой кислоты  с помощью фермента аcпартазы. С практической стороны он отличается тем, что в качестве исходных веществ для ферментативного синтеза используются фумаровая кислота и аммиак, крупнотоннажные продукты органического и неорганического синтеза. В отношении самой реакции процесс интересен тем, что фермент здесь всего лишь в одну стадию присоединяет молекулу аммиака к двойной связи: фумаровой кислоты, сразу приводя к оптически активной L-аспарагиновой кислоте. Наконец, особенностью процесса является и, что в нем впервые в технологической практике были использованы иммобилизованные клетки микроорганизма, содержащие, фермент в его естественной микробиой оболочке. Этот процесс былразработаняпонской фирмой «Танабе Сейяку» в 1993 г.

Сначала японсйие технологи  попытались использовать в качестве катализатора, микробную массу, состоящую из живых клеток микроорганизмов, содержащих внутриклеточный фермент, аопартазу. Однако время полуинактивации фермента в этих условиях у составляло всего 10 дней и было неприемлемым для технологии. Когда аспартазу выделяли из клеток и иммобилизовали в геле, время полуинактивации увеличилось до 30 дней. Когда же в гель включили сами микробные клетки и дополнительно усилили их путем химического связывания друг с другом и с гелем, стабильность катализатора резко возросла и время полуинактивации фермента составило уже 120 дней. Плотный гель с иммобилизованными в нем микробными клетками, содержащими аспартазу, формуют в кубики размерами 2—3 мм, набивают ими колонну объемом 1 м³  и пропускают через нее раствор фумарата аммония. На выходе из колонны L-аспарагиновую кислоту кристаллизуют, центрифугируют и промывают холодной водой. Процесс практически полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Масштабы производства на фирме «Танабе Сейяку»—1700, кг чистой L-аспарагиновой кислоты в день на реактор объемом 1 м³.

9.4. Получение L-яблочной кислоты

Яблочная кислота находит  спрос на мировом рынке в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и фармацевтических препаратах. Химическим путем (гидролизом ангидрида яблочной кислоты) производят только рацемическую смесь оптических изомеров яблочной кислоты, в то время как оптически активный L-изомер, который получают микробиологическим способом, пока слишком дорог для широкого промышленного производства.

В то же время L-яблочную кислоту можно получать ферментативным путем из той же фумаровой кислоты, из которой получают L-аспарагиновую кислоту (см. выше). Только в данном случае ферментом является фумараза, которая присоединяет по двойной связи фумаровой кислоты не аммиак, а воду. В остальном реакция происходит так же, и в качестве ферментного катализатора используют клетки, содержащие фумаразу и иммобилизованные в гель. В обычных (интактных) клетках время полуинактивации фумаразы составляет 6 дней, в иммобилизованных в полиакриламид-ный гель — 55 дней.

Недавно компания «Танабе  Сейяку» изменила технологию и перешла  к другому микробному источнику  фумаразы, стабильность и продуктивность которого выше в два раза по сравнению с предыдущим. Помимо этого, компания стала использовать вместо поли-акриламидного геля в качестве носителя для иммобилизованных клеток другой гель на основе каррагинана — полисахарида из морских водорослей. В итоге время полуинактивации иммобилизованного фермента составило 160 дней и продуктивность его действия возросла в 5,2 раза по сравнению с прежней технологией.

9.5. Получение  без лактозного молока

Лактоза, или молочный сахар, содержится в достаточно больших количествах в молоке и молочной сыворотке. Этот сахар характеризуется малой сладостью и низкой, растворимостью, и именно из-за его присутствия происходит кристаллизация мороженого и других молочных изделий и продуктов, которая иногда случается и приводит к малоприятным вкусовым ощущениям.

Молекулы лактозы состоят  из глюкозы и галактозы и распадаются на них при гидролизе под действием лактазы или b-галактозидазы. Молоко после такой обработки приобретает новые диетические качества, поскольку определенная часть населения не может употреблять молоко именно из-за наличия в нем лактозы. Это качество организма получило название лактазной недостаточности, и в целом по направлению с севера нашей планеты на юг доля людей, испытывающих лактазную недостаточность заметно возрастает. В Африке, например, целые племена и этнические группы не могут пить молоко домашних животных из-за сильных аллергических откликов или неприятных физиологических ощущений. В то же время они нормально усваивают молоко, не содержащее лактозы или предварительно обработанное иммобилизованной лактазой.

Первый коммерческий процесс получения безлактозного молока с использованием иммобилизованной лактазы был осуществлен итальянской фирмой «Сентрале дель Латте» в Милане. Получаемое диетическое молоко несколько слаще обычного, поскольку глюкоза более сладкая, чем лактоза, однако это не мешает его употреблению. Стабильность иммобилизованного фермента достаточно высока, и после 50 дней работы он сохраняет 80% первоначальной активности. В настоящее, время завод в Милане производит 10 т безлактозного молока в день.

9.6. Получение сахаров из молочной  сыворотки

Молочная сыворотка  содержит в своем составе большое  количество лактозы—около 5% в жидкой и 75% в высушенной сыворотке. Ферментативный гидролиз лактозы в этом случае открывает новые возможности получения сахаристых веществ и.з нетрадиционного сырья, вносит определенный вклад в решение кормовой проблемы и в проблему охраны окружающей среды, поскольку сыворотка большей частью не утилизируется.