Оценка формового разнообразия, селекция и технология размножения

Для приготовления сиропа используется сок только нескольких видов клена, а именно: черного, красного, серебристого и сахарного. Свежие, мелко измельченные листья прикладывают к поврежденной коже, отвары и сок пьют при авитаминозе и астении. Вирусные инфекции, болезни почек, гепатит, бронхит лечатся эффективнее, если в комплекс лекарств добавляются целебные средства из клена. Бытует мнение, что зола коры дерева, разведенная в воде, способствует хорошему росту волос.

 

 

2. Методика  выделения биологически активного вещества

Определение витаминов В1 и В2 в растениях

В растениях содержание витаминов невелико. Вместе с тем отдельные органы и ткани растений способны в большей степени накапливать их в своем составе. Так, овощные и плодовые культуры характеризуются высоким содержанием каротиноидов, витамина В, аскорбиновой и фолиевой кислотой. В семенах злаковых и зернобобовых культур много рибофлавина, тиамина, ниацина. В зеленых листьях растений накапливаются филлохиноны.

Тиамин, или витамин В1 в виде тиаминпирофосфата входит в состав окислительных декарбоксилаз кетокислот. Методы определения тиамина основаны на его спектральных свойствах. Максимум поглощения тиамина составляет X = 250 нм. Продукт окисления тиамина красной кровяной солью в щелочной среде - тиохром флюоресцирует при ультрафиолетовом освещении.

Рибофлавин, или витамин B2, идентифицирован в природных объектах в виде четырех форм, одна из которых свободный рибофлавин, остальные связаны с нуклеотидами (флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид) и с белком. Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов, осуществляющих реакции дегидрирования. Окисленная форма рибофлавина так же, как и тиамина, способна флюоресцировать в ультрафиолетовом свете. Максимум поглощения рибофлавина лежит в области X = 225 нм.

Цель работы - качественное и количественное определение витаминов B1 и В2 в вытяжках из вегетативных частей растений, корнеплодов и плодов.

Реактивы и материалы: 0,1 н раствор H2SO4, 10 % трихлоруксусная кислота (ТХУ), 15 % раствор NaOH, 1 % раствор красной кровяной соли K3[Fe(CN)6], 0,1 % раствор NaOH, бромид тиамина (хлорид тиамина), рибофлавин,

Na2S2O4 • H2O либо NaBH4, металлический  цинк, пепсин либо трипсин, изоамиловый спирт, изобутиловый спирт, этиловый спирт, диэтиловый эфир, дистиллированная вода, фарфоровые ступки с пестиками, конические колбы объемом 100 мл, водяная баня, мерные цилиндры, пробирки, делительные воронки объемом 50 мл, бумажные фильтры, термостат, центрифуга, флюоресцентный спектрофотометр.

Ход работы

1. Извлечение витаминов

К навеске измельченного растительного материала массой 10-20 г прилить небольшое количество (2-5 мл) 0,1 н раствора H2SO4, после чего все тщательно растереть в ступке. Растертую массу поместить в коническую колбу на 100 мл, сюда же прибавить 30 мл 0,1 н раствора H2S04. Содержимое колбы следует выдержать в течение 20 мин на кипящей водяной бане для экстрагирования витаминов. После завершения процедуры экстрагирования смесь охладить и добавить в колбу 30 мг пепсина либо трипсина для перевода витамина в свободное состояние. Объем гомогената довести до 50 мл раствором серной кислоты. Провести ферментацию в течение 20 ч в термостате при 38 °С.

По истечении указанного времени вытяжку центрифугировать при 5000 об/мин и отфильтровать под вакуумом. К получившейся надосадочной жидкости прилить равный объем 10 % ТХУ и выпарить до 10 мл. Продолжить выпаривание вытяжки, удаляя избыток ТХУ 2-3-кратным промыванием смесью этилового спирта и диэтилового эфира (1:1), до объема 5 мл. Далее полученную вытяжку разделить на две части: одна идет на определение тиамина, а вторая - рибофлавина.

2. Получение тиохрома

В делительные воронки объемом 50 мл налить 2,5 мл полученной вытяжки. В одну из воронок (контрольную) прилить 1,5 мл 15 % раствора NaOH, перемешать и добавить 6 мл изобутилового спирта. В опытные воронки прибавить по 1,5 мл 0,04 % раствора красной кровяной соли в 15 % растворе NaOH, все содержимое перемешать и прилить 6 мл изобутилового спирта. Делительные воронки закрыть пробками и сильно встряхивать в течение 1 мин. Дать смеси отстояться, затем нижний слой следует слить. Для просветления спиртового слоя прилить 1 мл этилового спирта, встряхнуть, дать отстояться и полученный прозрачный раствор слить в пробирку для последующего спектрофотометрического анализа.

3. Флюоресцентная спектроскопия растворов тиохрома и ри-бофлавина

Полученные опытные растворы тиохрома перелить в кюветы и провести измерение интенсивности флюоресценции (длина волны возбуждения X = 250 нм). Максимум флюоресценции для тиохрома составляет X = 495-500 нм.

Аналогично провести процедуру измерения интенсивности флюоресценции для растворов рибофлавина (длина волны возбуждения равна X = 225 нм). Регистрировать максимум флюоресценции рибофлавина в области X = 525-530 нм.

Учитывая, что спектральные свойства окисленных и восстановленных форм тиамина и рибофлавина изменяются, провести их сравнительный флюоресцентный анализ. Рибофлавин окисляется 4 % раствором перманганата калия, который добавляется к вытяжке по каплям до исчезновения красноватой окраски, либо концентрированной HCl в присутствии металлического цинка. Восстановление окисленных форм тиамина и рибофлавина осуществить либо гидросульфитом натрия (Na2S2O4 • H2O) либо боргидридом натрия (NaBH4), добавляя эти восстановители в количестве 0,1-0,2 г на 1-2 мл раствора витаминов.

 

Количественное определение

1. Количественное определение витаминов В1 и В2. Для количественной оценки содержания витаминов в растительных образцах следует получить калибровочные графики зависимости интенсивности флюоресценции от концентрации. С этой целью необходимо:

• приготовить стандартные растворы витаминов тиамина и рибо-флавина (10 мг тиамина бромида (тиамина хлорида) растворить в 100 мл 0,01 н раствора HCl, 10 мг рибофлавина растворить в 100 мл 0,01 н раствора NaOH);

• провести окисление стандартного раствора тиамина. Для этого в делительную воронку налить 1 мл рабочего раствора и прибавить 4 мл воды. (Примечание. Рабочий раствор приготовить непосредственно перед окислением. Для этого взять 1 мл стандартного раствора и довести его до 100 мл дистиллированной водой - 1 мл этого рабочего раствора будет содержать 1 мкг тиамина бромида). Затем в воронку прилить щелочной раствор красной кровяной соли и провести процедуру разделения и просветления растворов, как это описано выше. Окисленный и просветленный раствор перелить в пробирки для флюориметрии;

• приготовить рабочий раствор рибофлавина. Для этого следует взять 1 мл стандартного раствора рибофлавина и довести его до 100 мл дистиллированной водой (1 мл этого раствора будет содержать 1 мкг рибофлавина);

• построить калибровочные кривые для растворов тиохрома и ри-бофлавина, взяв следующие концентрации для тиамина - 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 мкг, а для рибофлавина - 0,005; 0,010; 0,020; 0,05 мкг.

По калибровочным кривым рассчитать содержание тиамина и рибофлавина (мкг/мл) в растительных образцах. Количество витаминов в исследуемом материале (мгк/г сырой массы) вычислить по формуле:

X=c*V/m

где, с - содержание витамина в 1 мл вытяжки, найденное по калибро-вочной кривой;

V - объем экстракта в  мл; m - масса исследуемого материала  в граммах.

Сделать выводы.

 

 

3. Задачи и методы селекции клена.

Клены – спутники главных пород при создании лесных культур, лучшая примесь к дубу и ясеню европейскому при выращивании защитных насаждений. Клен ясенелистный – порода быстро растущая в молодости, пригодная для защитных насаждений юго-востока и Западной Сибири. Его недостаток – кривоствольность. Поэтому перед селекционерами была поставлена задача – гибридизацией кленов увеличить зимостойкость европейских кленов и добиться стройности ствола клена ясенелистного.

В скрещиваниях использовались два местных вида (клен остролистный и татарский) и два североамериканских (серебристый и ясенелистный). Клен остролистный однодомный насекомоопыляемый вид, в щитке 7–13 цветков, иногда преобладают типично женские или мужские. Деревья отличаются наличием преимущественно женских или мужских цветков. Безуспешно опылять женские цветки, на «мужских» деревьях. Как показал наш опыт, для опыления можно использовать женские цветки, изолируя их, без кастрации неполноценных тычинок. Клен ясенелистный двудомный, клен серебристый и клен татарский – однодомные, с различными цветками в кисти.

Попытки опылять невысокие деревья клена ясенелистного в возрасте 25–30 лет оказались неудачны. После опыления клена ясенелистного пыльцой клена остролистного на молодом деревце формировалось много хороших семян.

При опылении клена остролистного пыльцой клена ясенелистного без кастрации пыльников в женских цветках, но с выщипыванием из кисти всех мужских и «промежуточных» завязь составляла 34 %. Все гибриды похожи на материнский вид и не превышают его по высоте.

У клена остролистного х клен ясенелистный увеличилось число лопастей у листьев. Среднее число зубцов меньше у гибридов и почти такое же, как у опылителей. Уменьшилась длина и ширина листовой пластинки и длина черешка.

Среди 64 экземпляров обнаружено 6 обоеполых: в одной кисти цветки мужские, женские или даже обоеполые. Семена их всхожие, потомство обоеполое.

У клена остролистного пыльца крупнее, чем у клена ясенелистного. У гибрида клен остролистный х клен ясенелистный пыльца уменьшилась, а от реципрокного скрещивания – увеличилась.

Анализ таблицы 1 показывает, что клен остролистный х клен ясенелистный на 23–30 % превышает свой контроль, а обратные гибриды – на 14 %.

 

 

 

 

 

Таксационные показатели роста гибридов и родительских форм клена

Вид, гибрид	Высота, м		Диаметр, см
	средняя	максимальная	средний	максимальный
Ясенелистный х остролистный	4,5	5,0	4,7	6,0
Остролистный х ясенелистный	4,5	5,1	4,9	6,5
Ясенелистный (контроль)	3,9	4,7	3,8	5,9
Остролистный (контроль)	3,4	4,8	2,9	4,6

Табл.1 Показатели роста гибридов и родительских форм клена

Водоудерживающая способность листьев клена остролистного выше контроля, а при реципрокном скрещивании этого не наблюдается. Из семян гибридов кленов во многих хозяйствах выращивают сеянцы, используемые в защитных насаждениях.

Гибриды клена ясенелистного в третьем поколении приобрели новые качества: 17 % семян по размерам и до 40 % по весу соответствуют контролю. К тенденциям доминирования гибридов клена ясенелистного относятся: увеличение ширины сложного листа, изменение окраски однолетних побегов, увеличение ширины крылаток семян, укорачивание семенных кистей [3]. Для полного доминирования характерны: появление у некоторых растений листьев с простыми пластинками (потеря непарноперистости), стройность стволика и увеличение количества одноствольных растений. Доминирование закреплено в поколениях.

Новообразованиями являются увеличение количества устьиц вдвое по сравнению с контролем и наличием на листьях устьиц обоих видов.

У гибридов клен остролистный х клен ясенелистный параллельно изменениям реципрокного скрещивания изменился характер листа и увеличились его размеры.

При одновременном цветении совместно произрастающих видов клена образуются гибриды. В литературе описаны гибриды клен полевой X французский (A. monspessulanum L.), полевой х колосоцветный,пальмовидный X японский (A. palrnatum Thunb. X A. japonicum Thunb.) и др.

П. Дансеро и А. Лафон указывают, что в районе совместного произрастания клена сахарного и черного (A. nigrum Michx), в Восточной Канаде, эти два вида могут образовать гибриды. Виды клена хорошо поддаются искусственной гибридизации. Целью гибридизации клена является общее повышение его жизнестойкости, а также повышение солеустойчивости, с тем чтобы создать породу, пригодную для культуры на более тяжелых и солонцеватых почвах. Особенно желательно выведение зимостойкого клена для степей Казахстана и Сибири, так как пока в этих районах произрастают три недостаточно полноценных вида: клен ясенелистный, отличающийся в этих условиях недолговечностью и недостаточной стройностью ствола, клен татарский и клен Гиннала, хотя и хорошо растущие, но имеющие форму кустарников. Нами искусственно получены гибриды клена остролистный X ясенелистный, ясенелистный X серебристый, татарский X полевой, татарский X остролистный, татарский х ясенелистный. Гибриды первого поколения морфологически походят на материнский вид, в некоторых случаях произошли ясно видимые изменения в форме почек, в размерах и форме листьев.

По исследованиям Н. Я. Селивановой, клетки меристемы у гибридов в точках роста более крупные, чем у исходных видов. Частично этим и объясняется большая быстрота роста гибридов по сравнению с родительскими видами. Гибриды содержат в листьях больше аскорбиновой кислоты, чем исходные виды. Особенно сильные изменения обнаружены в строении цветков. Например, у гибридов клена ясенелистного имеются экземпляры, у которых мужские и женские цветки расположены в одной кисти, как у клена серебристого, и экземпляры с обоеполыми цветками. Среди гибридов клен ясенелистный X остролистный выделилось несколько экземпляров с обоеполыми цветками и соцветиями, не имеющими общих цветоножек. При свободном опылении потомство обоеполых деревьев также имеет много растений с обоеполыми цветками. Очень заметные изменения установлены М. А. Бескаравайной в форме крылаток и характере расположения их в кисти. Кисти семян гибридов клен остролистный X ясенелистный иногда приобретают такую же длину, как и кисти отцовского вида, т. е. почти вдвое больше кисти клена остролистного. Иногда встречаются кисти, как у клена остролистного, но с большим количеством семян. В условиях Камышина, на легких песчаных почвах, прирост по высоте у гибридов клена больше, чем у контрольных деревьев. Поданным И. В. Калининой, в 1955 г. однолетние гибриды (осенний