Диагностические препараты. Диагностикумы и антигены

Так, для приготовления дифтерийного и столбнячного эритроцитарных диагностикумов, формалинизированные эритроциты отмывают один раз физиологическим раствором (рН 7,2), разводят их до 2,5 % концентрации, добавляют равный объем таннина в разведении 1:20000, взбалтывают и выдерживают 15 минут при комнатной температуре. Затем эритроциты отмывают 3 раза пятью-шестью объемами физиологического раствора (рН 7,2). Проверяют на отсутствие спонтанной агглютинации, готовят 2,5 % взвесь, к которой прибавляют очищенные, концентрированные анатоксины - дифтерийный (10-20 Lf на один миллилитр взвеси) или столбнячный (5-10 ЕС на один миллилитр взвеси).

Смесь выдерживают при 37 °С – 3 часа. За один час до окончания инкубации добавляют 1 % формалина, встряхивают жидкость до образования равномерной взвеси. После этого срока эритроциты снова отмывают три раза нейтральным физиологическим раствором, содержащим 1 % формалина. Отмытые сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,0) с формалином (1 %) так, чтобы в 0,05 мл взвеси содержалось 6-8 млн. эритроцитов (подсчет в камере Горяева). В препарате проверяют густоту взвеси, отсутствие спонтанной агглютинации, специфическую активность с соответствующими иммунными сыворотками. Для контроля применяют эритроциты, обработанные таким же способом только не сенсибилизированные антигеном.

Срок годности столбнячного и дифтерийного эритроцитарных диагностикумов – 6 месяцев [4].

При изготовлении туляремийного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном, полученным по методу Буавена и Мезробеану из высушенных туляремийных бактерий.

Для постановки реакции употребляют 2,5 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Активность препарата проверяют в реакции непрямой гемагтлютинация с агглютинирующей противотуляремийной сывороткой. Если сенсибилизированные эритроциты агглютинируются этой сывороткой в разведении ее меньшем, чем предусмотрено инструкцией – эритроцитарный диагностикум бракуется.

Срок годности препарата  – 9 месяцев [6].

Эритроцитарный Ви-диагностикум представляет собой формалинизированные эритроциты человека 0 (1) группы, сенсибилизированные очищенным Ви-антигеном брюшнотифозных бактерий, в фосфатно-буферном физиологическом растворе. Препарат стандартизируют таким образом, чтобы 1 мл взвеси содержал 50 млн. эритроцитов. Специфическая активность эритроцитарного Ви-диагностикума определяется в РНГА с одной адсорбированной брюшнотифозной Ви-сывороткой и пятью сыворотками людей, привитых против брюшного гифа. Препарат годен в течение шести месяцев [5].

 

2.2 Риккетсиозные диагностикумы

Для дифференциальной диагностики  риккетсиозов серологическим методом в постановке реакций связывания комплемента и агглютинации широко применяются цельные риккетсиозные антигены. Для приготовления диагностикумов из риккетсий могут быть использованы куриные эмбрионы, белые мыши, платяные вши. Для заражения куриных эмбрионов используются штаммы риккетсий Провачека, Музера и Бернета.

Риккетсии культивируют в  желточном мешке эмбриона. После размножения риккетсий желточные мешки, извлеченные стерильными пинцетами из вскрытых яиц, помещают в стерильные банки со стеклянными бусами (5-10 желточных мешков в банку) и измельчают путем тщательного встряхивания. К полученной массе добавляется физиологический раствор из расчета 10 мл на 1 желточный мешок. Все вновь тщательно встряхивается для лучшего измельчения тканей, и затем, в каждую банку добавляется еще 100 мл физиологического раствора, содержащего формалин в количестве от 0,8 (для культур риккетсий Провачека и Музера) до 1 % (для риккетсий Бернета) и 10 % фосфатного буфера с рН 7,0. После встряхивания банки помещаются в рефрижератор и хранятся там до истечения срока обезвреживания [1] .

В дальнейшем полученная указанным  способом первичная взвесь риккетсиозного материала сводится в бутыли соответствующей емкости (по 100 желточных мешков).

Дальнейшая обработка  первичной взвеси риккетсий Провачека и Музера производится не ранее 48 часов пребывания риккетсиозного материала в формалинизированном физиологическом растворе, а риккетсий Бернета только после 15 дней пребывания в этих же условиях.

Обработка первичной взвеси производится методом сепарирования или центрифугирования в комбинации с эфирной обработкой. Осадок после третьего сепарирования состоит обычно из чистых риккетсий. Сепарированием и эфирной обработкой достигается отделение риккетсий от тканевых примесей [2].

Риккетсиозная взвесь стандартизуется по оптическому бактерийному стандарту и доводится путем разведения стерильным физиологическим раствором с 5 % сахарозы до концентрации, соответствующей мутности 2 млрд. микробных тел в 1 мл. Стандартизованная взвесь разливается в ампулы по 0,5 мл, замораживается при t -20 – 25°С и высушивается в вакууме. Риккетсиозный антиген подвергается контролю на растворимость, правильность стандарта, ставятся реакции агглютинации и связывания комплемента с типовой иммунной сывороткой, проводится микроскопический контроль на отсутствие бактериального загрязнения. Сухой антиген хранится при температуре +4 – +10°С. Он годен в течение 2,5 лет.

Для серологической диагностики  некоторых риккетсиозов, например, исторического сыпного тифа, применяется  антиген из риккетсий, культивированных в кишечниках вшей [1] .

Для изготовления антигена используется несколько штаммов  риккетсий Провачека, выделенных от больных сыпным тифом. Этими штаммами заражают с помощью микроклизмы взрослых, здоровых платяных вшей. До момента гибели их кормят один раз в день на донорах, перенесших сыпной тиф или привитых.

Зараженные вши погибают в сроки от четвертого до восьмого дня. После гибели их помещают в 0,5 % фенол, через 2-3 дня вскрывают, отсепарировают кишечники, растирают их в ступке с физиологическим раствором, содержащим 0,5 % фенола, затем взвесь центрифугируется или оставляется для осаждения крупных частиц [1].

Антиген представляет собой  взвесь в физиологическом растворе убитых фенолом риккетсий Провачека, культивированных в кишечниках зараженных вшей. Он содержит в 1 мл 3-5 млрд. риккетсий (50-60 кишечников зараженных вшей).

Для предупреждения порчи  от замерзания во время транспортировки  в некоторые серии добавляют 10 % глицерина; это не отражается на специфической активности препарата, но делает его более морозоустойчивым. Готовый антиген проверяют на агглютинабильность сыворотками сыпнотифозных больных или типовыми иммунными сыворотками и сыворотками здоровых людей. Готовый антиген испытывается на специфическую стерильность путем внутрибрюшинного введения 2 мл взвеси осадка антигена морским свинкам или вшам по методу Вейгля. У свинок ежедневно измеряют температуру. Если у них не отмечается повышения температуры, антиген считается специфически стерильным. При заражении вшей микроскопическое исследование мазков из кишечников проводится с 6-го по 10-й день, в мазках не должны обнаруживаться риккетсии [5].

Готовый диагностикум разливается в ампулы по 1,5 или 10 мл. Срок годности равен 1 году. Препарат проходит контроль на стерильность, соответствие стандарту и агглютинабильность.

Применяется в реакции макроагглютинации. Характер агглютинации риккетсий мелкозернистый. Реакция высокоспецифична. Положительный результат 1:40 считается диагностическим титром.

В разведенном виде препарат можно применять для реакции  связывания комплемента.

Помимо вышеперечисленных  антигенов для диагностики эпидемического сыпного тифа и крысиного риккетсиоза применяется антиген, приготовленный из легких белых мышей, зараженных риккетсиями Провачека и Музера.

Богатые риккетсиями мышиные легкие размельчаются в ступке с кварцевым песком и разводятся формалинизированным физиологическим раствором из расчета 3-4 мл на легкое.

Далее формалинизированная взвесь центрифугируется дважды: один раз при 1500 оборотах в минуту для удаления тканевых примесей, другой раз при 3000 оборотах в минуту для получения риккетсий в осадке. Осадок обрабатывается физиологическим раствором, содержащим 0,4 % формалина и 0,5 % фенола.

В дальнейшем он подвергается обработке эфиром, после чего к нему добавляется сахароза и производится высушивание из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.

Готовый препарат представляет собой сухой антиген из хорошо очищенных убитых формалином риккетсий, подвергнутый контролю по вышеописанной  методике [3].

 

2.3 Вирусные диагностикумы - антигены

Вирусные диагностикумы представляют собой антигены, используемые для серологических реакций. В зависимости от цели применения их подразделяют на антигены для реакции связывания комплемента и антигены для реакции торможения гемагглютинации.

Для изготовления диагностикумов из разных вирусов используются преимущественно следующие инфицированные материалы: для вируса гриппа - аллантоисная жидкость, для эпидемического паротита - амниотическая или аллантоисная жидкость, для орнитозов и лимфогранулемы - желточные мешки куриных эмбрионов, для вирусов энцефалитов - мозговая ткань мышей, куриных эмбрионов или культура тканей, для аденовирусов и полиомиелита - культуральные жидкости. Диагностикумы из аллантоисной и амниотической жидкости употребляют в нативном виде, другие - требуют специальной сложной обработки, так как обладают антикомплементарными свойствами [2].

Методы обработки антигенов делятся на физические и физико-химические. Из физических методов наибольшее применение имеет метод повторного замораживания и оттаивания, т.е. термолизис. Из физико-химических методов - обработка эфиром и хлороформом.

Метод термолизиса заключается в следующем: готовится 10 % суспензия на физиологическом растворе из инфицированной ткани, куда добавляется 2 % инактивированной сыворотки морской свинки. После 18-20 часового экстрагирования при 4 °С крупные тканевые частицы удаляют путем центрифугирования в течение 30 минут при 2500 оборотах. Надосадочная жидкость подвергается пятикратному замораживанию (при -7 °С) и оттаиванию (при +7 °С). Затем жидкость центрифугируют в течение часа при 3500 оборотах в минуту. Приготовленный таким образом диагностикум представляет собой слегка опалесцирующую жидкость [2].

Обработка вирусных диагностикумов физико-химическим методом заключается в том, что готовят суспензию, как описано выше для термолизиса, к ней добавляют полуторный объем эфира или хлороформа и в течение 2 часов производят встряхивание. Материал помещают на 18 часов в холодильник при 4 °С. Затем центрифугируют в течение 30 минут при 3000 оборотах в минуту. Происходит расслоение суспензии. В случае обработки эфиром антиген будет в нижнем слое, а при обработке хлороформом – в верхнем. Готовый антиген по внешнему виду представляет прозрачную жидкость. Вирусные диагностикумы не должны содержать живых вирусов. Инактивирование их производится либо прогреванием (37 °С), либо действием химических веществ (формалин, бетапропиолактон).

Существует значительное количество модификаций приготовления антигенов применительно к тому или иному вирусу. Выпускаются вирусные, антигены для диагностики следующих заболеваний: японского и клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, орнитозов, гриппа и эпидемического паротита, венесуэльского энцефаломиелита, западного энцефаломиелита лошадей, аденовирусных инфекций и др.

При многих инфекционных заболеваниях изменяется реактивность организма к возбудителю инфекции или его продуктам. Такая измененная реактивность организма называется инфекционной аллергией [1] .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ежегодно в нашей стране миллионы людей сельскохозяйственных животных болеют различными инфекциями, в том числе острыми кишечными  заболеваниями. Экономический ущерб  от этих заболеваний огромен.

Одним из важных этапов борьбы с инфекциями является их ранняя диагностика. Наиболее длительным и трудоемким этапом микробиологического исследования при проведении лабораторной диагностики  того или иного инфекционного  заболевания является изучение биохимических  свойств патогенных микробов. Каждый микроорганизм характеризуется  специфическим спектром ферментов. Поэтому изучение биохимической  активности микроорганизмов играет важную роль в лабораторной практике при идентификации микроорганизмов. Биохимическая активность положена в основу их классификации и всегда используется для установления родовой  и видовой принадлежности выделяемых возбудителей [1].

Бурный научно-технический  прогресс во всех областях знаний, в  том числе и в области микробиологических исследований, сопровождается разработкой  и созданием быстрых, простых  и экономичных методов биохимической  экспресс-индикации микроорганизмов [3].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. / Л.Б. Борисов, – М.: Наука, 2005 г. – 156 с.
2. Виестур У.Э. Биотехнология: биологические агенты, технология, аппаратура. / У.Э. Виестур – Рига: Знание, 2008 г. – 169 с.
3. Егоркина, Н.Е. Биотехнология. / Н.Е.Егоркина. – М., Высшая школа, 2005 г. – 543 с.
4. Егорова, Н.С. Промышленная микробиология. / Н.С. Егорова, – М.: Высшая школа, 2009 г. – 192 с.
5. Львов, Д.К. Медицинская вирусология. / Д.К. Львова, - М.: Медицинское информационное агентство, 2008 г. - 238 с.
6. . Петров, В.Д. Иммунология. / В.Д. Петров, - СПб: Лань, 2010 г. – 575 с.