Направления инженерной энзимологии

Инженерная энзимология – это новое научно-техническое направление, появление которого связано с необходимостью интенсификации биотехнологических процессов. Задачи инженерной энзимологии - конструирование органических катализаторов (энзимов) с заданными свойствами на основе ферментов и полиферментных систем, выделенных из клеток или находящихся в них. Термин "заданные свойства" имеет в виду, что эти свойства задаются практическими потребностями в данном катализаторе, условиями проведения ферментативного процесса, специифичностью, необходимой производительностью и т.д. Инженерная энзимология основана на принципах органического и ферментативного катализа, химической технологии, биотехнологии и биохимии и со времени своего зарождения целиком обращена к практике. Хотя основная направленность современной инженерной энзимологии – использование каталитической активности иммобилизованных ферментов и клеток, ее рамки гораздо шире. Цель этой дисципли-ны – разработка научных основ применения ферментных катализаторов для создания новых биотехнологических производств, новых методов в диагностике и терапии, органическом синтезе и др., а также решение фундаментальных проблем энзимологии при помощи иммобилизованных ферментов.

Иммобилизованные ферменты. Ферменты в качестве биологических катализаторов применяются в различных отраслях промышленности - пищевой, текстильной, фармацевтической, кожевенной, в медицине, сельском хозяйстве, в тонком органическом синтезе и т.д. Более широкое использование ферментов в биотехнологии до последнего времени сдерживалось вследствие ряда причин, а именно:

– трудоемкости отделения  ферментов от исходных реагентов  и продуктов реакции;

– нестабильности ферментов при хранении и при действии различных факторов; высокой стоимости чистых ферментных препаратов.

Создание биокатализаторов нового поколения - иммобилизованных, т.е. связанных ферментов открыло  перед прикладной энзимологией новые  перспективы. Иммобилизация фермента – это методический прием, при  котором молекулу биокатализатора  включают в какую-либо фазу, отделенную от фазы свободного раствора, но способную обмениваться с ней молекулами субстрата, эффектора или ингибитора. В качестве такой фазы может применяться, например, уголь (это установлено еще в 1916 г. Дж. Нельсоном и Е. Гриффином). В 1959 г. был применен принци-пиально новый методический прием - ковалентное связывание. С этого времени и ведется целенаправленная разработка гетерогенных катализаторов на основе ферментов. Иммобилизованные ферменты имеют существенные преимущества. Так, например, они легко отделимы от реакционной среды. Это дает возможность остановить реакцию в любой момент, получить продукт, незагрязненный катализатором, и использовать ферментный препарат многократно. Иммобилизованные ферменты технологичны, что определяется возможностью вести биотехнологический процесс непрерывно и регулировать скорость катализируемой реакции и выход продукта путем изменения скорости протока. Подбором соответствующих носителей и методов иммобилизации можно целенаправленно модифицировать такие свойства ферментов, как специфичность, рН-, температурозависимость, а также стабильность фермента при денатури-рующих воздействиях. Успешное использование иммобилизованных ферментов в значительной мере определяется выбором подходящего сочетания носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетики реакций с участием таких катализаторов.

Применение иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферменты можно использовать, главным образом, в трех направлениях:

1. Анализ различных  веществ, в качестве лечебных средств и биокатализаторов для исполь-зования в биотехнологических производствах.

2. Лечебные средства. Такие средства применяются либо  в том случае, когда необходимый  фермент отсутствует в тканях  вследствие генетических или  других нарушений, либо в качестве агентов, разрушающих нежелательные компоненты, например, мочевину. Использование чужеродных (бактериальных) ферментов нежелательно вследствие того, что они могут стать причиной аллергических реакций и, кроме того, они крайне неустойчивы. Иммобилизация позволяет обойти эти барьеры, так как она повышает стабильность фермента и препятствует его взаимодействию с иммунной системой макроорганизма. Например, в аппарате "искусственная почка", предназначенном для освобождения крови от различных шлаков, в том числе и мочевины, путем ультрафильтрации, используется колонка с иммобилизованной уреазой. Ферменты применяют в лечебных целях и тогда, когда они необходимы, но по причине различных патологических процессов отсутствуют, например, для растворения кровяных тромбов.

3. Применение в различных  производствах. Иммобилизованные  ферменты широко использу-ются  в бумажной, текстильной, химической  и фармацевтической промышленности, а также для обработки сточных  вод.

Иммобилизация энзимов  повышает их устойчивость к нагреванию, изменению реакции среды, увеличивает срок их действия, облегчает отделение их от продуктов реакции, дает возможность использовать многократно. Иммобилизация позволяет осуществлять непрерывные каталитические процессы, получать продукцию, не загрязненную энзимом. Это очень важно в ряде пищевых и фармакологических производств.

Данный метод применяют  для получения антибиотиков, например на основе иммобилизованного энзима – пенициллинамидазы, что позволяет  снижать расход сырья и себестоимость  продукта, увеличивать объем производства.

Такие энзимы перспективны в химической промышленности, при  получении тканей, кожи, бумаги, при  производстве сахара для диабетиков, некоторых гормональных препаратов, в пищевой промышленности для  получения сиропа, улучшения качества молока и ряде других производств. В медицине иммобилизованные энзимы перспективны в борьбе с опухолями, тромбами.

Энзимы используются в технологических процессах пищевой промышленности: для получения глюкозно-фруктозного сиропа, глюкозы из крахмала, улучшения качества молока и ряде других производств. Проходит промышленную проверку технология переработки целлюлозы в глюкозу.

Разработаны методы экономичных  биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов, при этом не требуется выделять и очищать энзимы. Иммобилизованные клетки микроорганизмов позволяют получать ряд ценных веществ: аминокислот, антибиотиков, органических кислот, стероидов, спиртов и др. Они используются также для очистки сточных вод, переработки сельскохозяйственных и промышленных отходов.

В большинстве случаев биотехнологические процессы рассчитаны на использование  живых клеток и тканей различного происхождения, и даже в инженерной энзимологии применение молеклул ферментов  сопряжено с рядом ограничений, присущих живым клеткам или тканям К их числу относят поддержание оптимальных температуры (достаточно низкой), рН, стерильности, концентрации растворенного кислорода (в случаях эксплуатации биообъектов — аэрофилов) Микробные клетки, за редким исключением (например, микоплазмы), и клетки растений имеют клеточную стенку , которой не обладают клетки животных организмов, вирусы как организованные частицы реплицируются и паразитируют на живых культурах клеток или в тканях, поэтому отмеченные выше ограничения относятся больше к этим последним, а не к вирусным частицам Наличие клеточной стенки у биообъекта заведомо обеспечивает ему более высокую устойчивость в различных условиях существования, чем биообъектам, лишенным клеточной стенки Даже при большой густоте, например, бактерий, они активно размножаются, если им обеспечиваются достаточные пищевые потребности

Фундаментальные исследования в области  энзимологии

Ферменты давно являются объектами  биотехнологии - их индустрия зародилась в начале XX в , и объемы ферментного  производства продолжают нарастать, а что касается публикаций о биокатализаторах, то в мире появляется более 10 000 статей ежегодно Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом ассортименте - организованным частицам (вирусами). Наука, изучающая ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимология - это ветвь или субдисциплина биологической технологии, изучающая биотехнологические процессы, в которых используется каталитическое действие ферментов .Главная задача инженерной энзимологии заключается в практической реализации ферментативных процессов в целях экономичного получения различных веществ и энергии для нужд народного хозяйства

Чтобы выйти на уровень инженерной энзимологии, необходимо решать многие основополагающие проблемы и задачи, к которым можно отнести

Существующие  ветви биотехнологическях субдисциплин (иммунобиотехнология, инженерная энзимология), применительно к конкретным производствам, рассмотрены в соответствующих  главах второй части учебника.

Биохимические процессы на основе инженерной энзимологии рассмотрены на примерах ферментов преимущественно микробного происхождения, поэтому и этот раздел включен в главу 9.

В ряде случаев  биообъектами являются первичные метаболиты микробного происхождения — ферменты, каталитическая активность которых  лежит в основе инженерной энзимологии.

Ферменты – это  специфические катализаторы белковой природы, вырабатываемые клетками и  тканями организмов. Они способны во много раз ускорять течение  химических и биохимических реакций, не входя в состав конечных продуктов. Практические применения ферментов основаны на их высокой каталитической активности и более высокой по сравнению с небиологическими каталитическими системами субстратной специфичностью. Источником ферментов служат растительные и животные ткани, микроорганизмы. Химический синтез ферментов в промышленных масштабах очень сложен, дорог и экономически не целесообразен. Микробиологический метод получения ферментов – наиболее перспективен. Его преимущества заключаются в следующем: 1) богатство ассортимента ферментов, синтезируемых микроорганизмами, 2) возможность управления ферментативными системами и составом производимых препаратов, 3) высокие скорости размножения микроорганизмов и возможность использования различных, в том числе доступных и недорогих субстратов. Ферменты в микробных клетках могут иметь как внутриклеточную локализацию, так и выделяться в окружающую среду. Последние более доступны для препаративного получения, поэтому в промышленных масштабах получают главным образом внеклеточные ферменты. Из описанных к настоящему времени более 2000 ферментов практическое значение имеют около 50.  
Согласно современной классификации, все ферменты подразделяются на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и линазы (синтетазы).  
Негидролитические ферменты – оксидоредуктазы, лиазы, изомеразы и лигазы применяются сравнительно редко. Наиболее широкое применение получили микробные гидролазы, взаимодействующие с пептидами, гликозидами и другими соединениями с участием воды. Среди гидролаз – гликозидазы, протеиназы, липазы.  
Гликозидазы катализируют гидролиз гликозидных соединений. Так, крахмал гидролизуют амилазы, продуцентами которых являются различные микроорганизмы (Bacillus, Aspergillus); декстраназа, взаимодействующая с гликозидными связями декстрана, синтезируется Penicillium purpurogenium; пуллоназа, гидролизующая пуллан, гликоген, декстрины, продуцируется бактериями Klebsiella; инвертаза синтезируется многими представителями рода Aspergillus; целлюлолитические ферменты, являющиеся сложным комплексом активных белков, воздействуют на различные участки молекулы целлюлозы. Фитопатогенные грибы Fusarium oxysporum, Erwinia образуют пектинолитические ферменты; анаэробные бактерии Clostridium felsineum продуцируют полигалактуроназу, пектинэстеразу. Очень разнообразны протеиназы, катализирующие разрыв пептидных связей белков с образованием пептидов и свободных аминокислот. Протеиназы различных микроорганизмов существенно различаются своими свойствами; среди продуцентов протеиназ – Aspergillus, Actinomyces, Clostridium, E.coli. Продуцентами липаз, осуществляющих гидролиз триацилглицеролов с образованием жирных кислот и глицерина, являются различные микроорганизмы (Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Geotrichum, Candida). Фосфокиназы, синтезируемые бактериями Clostridium, Bacillus, расщепляют сложные связи между жирными кислотами, глицерином и фосфатидной кислотой.  

История применения ферментов  уходит корнями в далекое прошлое. Некоторые ферменты, содержащиеся в природных растительных материалах, издавна использовались человеком для получения пива, спиртных напитков, производства хлеба и кисломолочных продуктов. Практика, основанная на коллективном опыте людей, намного опередила получение знаний и разработку научных основ для создания данных технологических процессов. Промышленная отрасль получения ферментных препаратов из природного растительного сырья стала зарождаться только в конце XIX столетия, а эра современной инженерной энзимологии насчитывает около 30 лет. Тем не менее, ферменты настолько широко вошли в нашу жизнь и настолько широко применяются в различных промышленных отраслях, что представить без них наше существование сегодня не представляется возможным. Промышленное получение и применение ферментов в различных технологических процессах составляет в настоящее время один из важнейших разделов новейшей биотехнологии.  
 
Огромное значение ферменты имеют в различных отраслях пищевой промышленности. В хлебопечении амилазы ускоряют процесс созревания и улучшают качество теста; их используют также для получения растворимого крахмала, патоки, декстрина. Грибные амилазы заменяют солод, лактазу используют для удаления молочного сахара из молока; инвертазы сахаров, предупреждающие кристаллизацию сахарозы, применяют в кондитерской промышленности. Комплекс ферментов – цитаз, используют для более полной экстракции соков из плодов и овощей, а также получения эфирных масел. Грибные глюкозидазы, освобождая продукты от остаточных сахаров, удлиняют сроки их хранения. С помощью каталазы из продуктов удаляют перекиси водорода, целлюлазы применяют для осахаривания крахмала из картофеля и зерна, а также увеличения выхода агар-агара из водорослей. Протеолитические ферменты микробного происхождения заменяют реннин в сыроделии. Липазы находят применение в производстве сухого молока и для ускорения созревания сыров.  
 
Пектинолитические ферменты издавна применяются для обработки льносоломы и получения из нее волокна. Амилолитические ферменты используют для удаления клея из тканей (расшлифовка); некоторые протеиназы применяют для удаления серицина и высвобождения шелковых волокон из шелка-сырца; для обезжиривания волокон используют липазы. В кожевенной промышленности при помощи протеолитических ферментов производят обезволашивание шкур и мягчение голья, ускоряют также процессы получения высококачественной шерсти. Ферментные препараты применяют в сельском хозяйстве при производстве кормов. Пектиназы и гемицеллюлазы повышают доступность и усвояемость кормов, ускоряют процессы силосования трудно- и несилосующихся зеленых кормов.  
 
Все большее применение ферменты находят в тонком органическом синтезе в процессах получения различных сложных соединений (аминокислот, пептидов, нуклеотидов, полусинтетических антибиотиков), а также в медицине. Ряд ферментов применяют в так называемой «заместительной терапии» для восполнения имеющегося ферментативного дефицита. Так, препараты протеиназ используют для удаления некротических тканей в ходе лечения гнойных ран и ожогов. Бактериальную аспарагиназу, расщепляющую аспарагин, необходимый лейкозным клеткам, применяют при ряде злокачественных заболеваний. Препараты протеиназ (террилин и стрептокиназа) обладают тромболитическим действием и применяются для борьбы с тромбозами. Холестеринэстераза гидролизует холестерин, локализованный на внутренних стенках кровеносных сосудов. Особое место занимают высокоочищенные ферменты, используемые в аналитике, микроанализе, биоэлектрокатализе.  
 
Таким образом, объемы и спектр выпускаемых ферментов, а также области их применения расширяются с каждым годом.  
 
Микроорганизмы, являющиеся источником для получения разнообразных ферментов, существенно различаются между собой по способности синтезировать данные биологически активные соединения. Эти различия проявляются как в ассортименте синтезируемых ферментов тем или иным микробным видом, так и в их активности и исходных свойствах. Ферменты – вещества белковой природы, поэтому в смеси с другими белками определить их не представляется возможным. Наличие фермента устанавливают по протеканию той реакции, которую катализирует фермент; количественное определение фермента проводят по величине образовавшегося продукта реакции либо по расходу исходного субстрата. Принята так называемая стандартная единица активности (E или U) – это количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в минуту при заданных стандартных условиях.  
 
Выбор продуцента необходимого фермента сопряжен с проверкой активности огромного количества культур, приводящей к отбору наиболее активного продуцента. Природные штаммы обычно не синтезируют ферменты в избыточных количествах, так как процесс их синтеза находится под строгим генетическим контролем. Исключение составляют конститутивные ферменты, например ферменты гексозомонофосфатного пути, которые синтезируются в больших количествах в любых условиях роста. Наряду с отбором наиболее активных штаммов-продуцентов ферментов из микробных коллекций или выделенных из природных источников, продуцирующих конститутивные ферменты, широко используют индуцибельные и репрессибельные ферменты, которые синтезируются клетками в результате изменения условий ферментации или генетического аппарата клетки. К индуцибельным относятся многие ферменты, имеющие коммерческую ценность.  
 
Индукция – это универсальный контроль для катаболических путей. Процесс ферментации с целью получения индуцибельных ферментов ведут в присутствии субстрата-индуктора. Так, для получения амилаз в среду вносят крахмал, рибонуклеазы – РНК, липаз – жиры, инвертазы – сахарозу и т.д. В результате способности синтезироваться индуцированно в ответ на заданный субстрат, возможно использование одной культуры для получения различных ферментов (табл. 3.1). Это свойство широко используется в промышленности для получения различных ферментов.  
 
Репрессии синтеза фермента конечным продуктом можно избежать, не допуская накопления последнего. При выращивании ауксотрофных штаммов на средах с дефицитом факторов роста накопления конечного продукта не происходит, и фермент дерепрессируется. В результате этого активность целевого фермента удается повысить многократно . Дерепрессии синтеза ферментов можно добиться, выращивая частичный ауксотрофный организм, который медленно растет на минимальной среде. Но стимулируется ростовым фактором. Возможно получение конститутивных мутантов, которые не репрессируются конечным продуктом. Такие мутанты получают, адаптируя организмы к токсическому аналогу конечного продукта с последующей селекцией на устойчивость.