Определение групп крови

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ

Групповая дифференциация присуща  не только эритроцитам, но и другим форменным элементам крови, а  также белкам плазмы. Для практической медицинской деятельности наиболее важен учет групповых различий эритроцитов, потому что именно он лежит в основе определения совместимости крови и предупреждения возможных осложнений при гемотрансфузиях.

6.1. Определение группы крови  по системе АВ0

Определение группы крови – это  несложная, но очень ответственная  процедура. Поэтому врач должен контролировать правильность проведения исследования и оценивать его результаты.

Группу  крови в системе АВ0 определяют, исследуя эритроциты индивидуума в  реакциях гемагглютинации с анти-А  и анти-В сыворотками. Результаты этой реакции обычно подтверждают, выявляя "нормальные" анти-А- и анти-В-антитела. В сыворотке, как правило, присутствуют "нормальные" антитела только к тем антигенам, которые не экспрессированы на эритроцитах данного индивидуума.

Прежде  чем приступить к исследованию, необходимо убедиться, что флаконы со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками правильно расположены в штативе, прозрачны, не содержат осадка и срок годности, указанный на их этикетках, не истек.

Ниже в  таблице показаны результаты реакции  с диагностическими препаратами  сывороток и эритроцитов при группах крови А, В, О и АВ.

Реагент	Фенотип исследуемого образца				Примечания
	А	В	0	АВ
Сыворотка анти-А	+	–	–	+	Реакцию проводят с исследуемыми эритроцитами и стандартной анти-сывороткой (определяют группу эритроцитов)
Сыворотка анти-В	–	+	–	+
Эритроциты группы А	–	+	+	–	Реакцию проводят с исследуемой  сывороткой и стандартными эритроцитами (определяют группу сыворотки)
Эритроциты группы В	+	–	+	–
Эритроциты группы 0	–	–	–	–

 

6.1.1. Методы определения группы крови по системе АВ0

Определение группы эритроцитов:

1. В четыре пробирки вносят сыворотку анти-А.
2. В другие четыре пробирки вносят сыворотку анти-В.
3. Отмытые эритроциты из исследуемого образца крови вносят в первую пробирку с анти-А и в первую пробирку с анти-В сывороткой.
4. Отмытые стандартные эритроциты серогрупп А, В и 0 добавляют соответственно во вторую, третью и четвертую пробирки с анти-А и анти-В-сыворотками для контроля реагентов.
5. Тщательно перемешивают содержимое всех пробирок.
6. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре.
7. Результаты (наличие или отсутствие агглютинации) учитывают визуально или под микроскопом.

Определение группы сыворотки:

1. Порции плазмы или сыворотки из исследуемого образца крови вносят в три пробирки.
2. В каждую пробирку добавляют отмытые стандартные эритроциты одной из трех групп: А, В или 0. Хорошо перемешивают.
3. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре.
4. Результаты (наличие или отсутствие агглютинации) учитывают визуально или под микроскопом.

В условиях отечественных клиник более широкое распространение получила методика определения группы крови по системе АВ0 на плоскости (фарфоровая тарелка или пластинка). Ее достоинство в том, что она менее громоздка. Технически ее проведение состоит из следующих операций.

В левой  части пластины делают надпись 0, в правой – В и по центру – А. Сверху пишется фамилия и инициалы исследуемого, у которого определяют группу крови.

Исследование  проводится в 2 сериях стандартных сывороток. Под соответствующими обозначениями  наносятся на плоскости по большой капле стандартной сыворотки (сверху – одна серия, под ней – другая). Таким образом получается 6 капель сывороток: 2 ряда по 3 капли. Кровь от больного получают непосредственно во время исследования. При помощи пипеток или стеклянных палочек по маленькой капле исследуемой крови наносят на плоскость рядом со стандартными сыворотками. После чего каждую каплю крови и сыворотки перемешивают. Пластину покачивают не менее 5 мин и добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия. Учет результатов реакции проводят не ранее чем через 5 мин.

Также используется перекрестный метод определения  групп крови, в котором определяются и группа эритроцитов, и группа сыворотки. Эта методика используется главным  образом для повторной проверки группы крови у доноров.

6.1.2. Аномальные результаты  при определении групп крови  по системе АВ0

Иногда результаты определения  групп крови по фенотипу эритроцитов  и специфичности нормальных сывороточных гемагглютининов не совпадают с  ожидаемыми. Следует отметить, что анти-А и анти-В-реагенты, как правило, высокоавидны и активно агглютинируют эритроциты, экспрессирующие соответствующие антигены. Менее выраженную реакцию при определении фенотипа эритроцитов считают аномальной. В то же время при определении сывороточных гемагглютининов более слабая агглютинация клеток наблюдается довольно часто.

Причины аномальных реакций можно суммировать следующим  образом:

1. Очень слабая реакция при определении сывороточных гемагглютининов наблюдается в следующих случаях:

а) если при постановке реакции используют эритроциты с несоответствующими подгруппами антигенов А и В;

б) если реакцию проводят с образцами  сывороток престарелых людей, детей  раннего возраста или больных;

в) если исследуют сыворотку близнецов  с иммунологическим химеризмом (в практике встречается довольно редко).

2. "Неожиданные" реакции при определении фенотипа эритроцитов в системе групп крови АВ0 происходят в таких случаях:

а) когда эритроциты фенотипов редких подгрупп типируют при помощи анти-А  реагента;

б) когда для типирования применяют антитела, специфичные к антигенам другой группы крови.

3. Слабая или "смешанная" агглютинация исследуемых эритроцитов под действием анти-А или анти-В-реагентов регистрируется в следующих случаях:

а) А-антигены эритроцитов принадлежат  к редкой подгруппе;

б) исследуемые  эритроциты способны к полиагглютинации;

в) эритроциты получены от близнецов с иммунологическим химеризмом или от больного, которому недавно перелили кровь.

6.2. Определение резус-принадлежности  крови

6.2.1. Основные понятия

В эритроцитах человека имеются 5 основных антигенов системы резус (D, C, c, E, e), из которых наиболее иммуногенным является антиген D – Rh(D). Наличие или отсутствие этого антигена определяет резус-принадлежность крови: лица, имеющие D-антиген, принадлежат к группе резус-положительных (среди лиц белой расы их приблизительно 85%); лица, не имеющие его, относятся к резус-отрицательным (их, соответственно, около 15%).

Иммуногенность  других (минорных) антигенов системы Rh значительно ниже и убывает  в ряду: с>Е>С>е. Определение минорных антигенов системы резус, как правило, производится при необходимости многократных трансфузий, в тех случаях, когда в сыворотке реципиента обнаружены иммунные антитела к антигенам системы резус, в том числе при индивидуальном подборе крови.

Антиген D имеет  слабые варианты, объединяемые в группу Dweek (Du), частота которой в популяции составляет около 1% . Эти эритроциты слабо или вообще не агглютинируются полными анти-Rh-антителами в реакции прямой агглютинации.

Доноры, содержащие Du, должны быть отнесены к резус-положительным, так как, во-первых, переливание их крови сенсибилизированным к D-антигену резус-отрицательным реципиентам может вызвать тяжелые трансфузионные реакции и, во-вторых, может вызвать иммунный ответ у резус-отрицательных реципиентов. Поэтому кровь доноров должна обязательно тестироваться на присутствие Du и, в случае его обнаружения считаться резус-положительной.

Реципиенты, содержащие антиген Du, должны быть отнесены к резус-отрицательным и им должна быть перелита только резус-отрицательная кровь, так как нормальный антиген D может вызвать у таких лиц иммунный ответ. Поэтому кровь реципиентов не обязательно тестировать на присутствие Du.

Резус-принадлежность определяется в реакции агглютинации с помощью моноклональных реагентов или изоиммунных антирезусных сывороток, предназначенных для выявления Rh(D)-aнтигена в реакции прямой агглютинации (на плоскости и в пробирочном тесте; в солевой среде; в присутствии высокомолекулярных усилителей; с эритроцитами, обработанными протеолитическими ферментами) или в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая проба Кумбса). Метод определения зависит от класса антител в реагенте: если в нем присутствуют полные антитела (класса IgM), то реагент используется для определения резус-фактора методом прямой агглютинации в солевой среде; если в нем содержатся неполные антитела (класса Ig G), то он используется в реакции агглютинации в присутствии высокомолекулярных усилителей (альбумина, желатины и др.), с эритроцитами, обработанными протеолитическими ферментами, в непрямом антиглобулиновом тесте .

6.2.2. Техника определения  резус-принадлежности крови

6.2.2.1. Реакция агглютинации  на плоскости с помощью анти-D моноклональных реагентов (полных  антител)

Определение проводят в помещении  с хорошим освещением. Наилучшие результаты тест дает при использовании высокой концентрации эритроцитов и температуре около +37° С, поэтому желательно использовать подогретую пластинку. Для исследования используют цельную кровь, отмытые эритроциты, эритроциты в плазме, сыворотке, консерванте или физиологическом растворе.

Процедура проводится в следующей последовательности:

1. Наносится большая капля (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.
2. Рядом наносится маленькая капля (около 0,03 мл) исследуемой крови (эритроцитов).
3. Тщательно смешивается реагент с кровью чистой стеклянной палочкой.
4. Через 10–20 с пластинка мягко покачивается. Несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 с, результаты реакции следует учитывать через 3 мин после смешивания.
5. Результаты реакции записываются немедленно после окончания.

При наличии агглютинации исследуемая  кровь маркируется как резус-положительная, если агглютинация отсутствует –  как резус-отрицательная. Если агглютинация намного слабее наблюдаемой с Rh (D)-положительными эритроцитами, исследуемая кровь принадлежит к подгруппе слабых антигенов Rh – Du. Для уточнения принадлежности такого образца крови к группе Du исследование проводят со вторым реагентом, содержащим IgG (неполные) анти-D антитела (см. гл. 6.2.2.3).

6.2.2.2. Реакция агглютинации  с помощью неполных анти-D-антител  (IgG) в присутствии высокомолекулярных  добавок

Реакция проводится либо со специально приготовленным реагентом, уже содержащим усилитель (универсальный реагент  с полиглюкином или альбумином для плоскости), либо усилитель добавляют в процессе проведения реакции (реакция конглютинации с желатином в пробирке).

Техника постановки реакции  агглютинации на плоскости не отличается от описанной в гл.6.2.2.1. Однако универсальные реагенты могут давать ложноположительную реакцию с резус-отрицательными эритроцитами за счет содержащихся в них высокомолекулярных веществ, а также могут вызывать агглютинацию эритроцитов, покрытых антителами другой (не антирезус) специфичности. Поэтому необходимо проведение параллельных тестов с контрольным раствором используемого усилителя, но без анти-0-антител. Если контрольный раствор вызывает агглютинацию эритроцитов, то результаты тестирования не достоверны и следует повторить определение с другим реагентом, содержащим полные антитела IgM (лучше с моноклональными).

Реакции конглютинации  с применением желатина. Для проведения этого теста могут быть использованы моноклональные реагенты и стандартные изоиммунные антирезус сыворотки с неполными антителами.

1. Вносят в пробирку 1 каплю (около 0,05 мл) исследуемой крови или взвеси эритроцитов (примерно 50%) в сыворотке.
2. Добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения при +46...+48°С.
3. Добавляют 2 капли (0,1 мл) реагента анти-D и смешивают.
4. Помещают пробирку в водяную баню с температурой +46...+48°С на 5–10 мин или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30 мин.
5. Доливают в пробирку 5–8 мл физиологического раствора и осторожно 1–2 раза переворачивают закрытую пробкой пробирку для перемешивания.
6. Определяют наличие агглютинатов, просматривая пробирку на свет невооруженным глазом или через лупу.
7. Немедленно записывают результаты определения.

Желатиновая проба требует обязательного  проведения следующих контролей:

со стандартными резус-положительными эритроцитами;

со стандартными резус-отрицательными эритроцитами;

с исследуемыми эритроцитами и раствором желатина, но без анти-0-антител.

При положительном  результате агглютинаты различимы  в виде агрегатов разной величины на прозрачном фоне – кровь является резус-положительной. При отрицательном результате в пробирке агрегатов нет, а видна равномерно окрашенная непрозрачная взвесь эритроцитов – кровь является резус-отрицательной. Если наблюдается мелкозернистая, вызывающая сомнение агглютинация, то кровь необходимо тестировать в непрямом антиглобулиновом тесте (см. гл.6.2.2.3). Результаты желатиновой пробы являются достоверными только в случае, когда желатин сам не вызывает агглютинацию исследуемых эритроцитов, а результаты контролей со стандартными эритроцитами соответствуют ожидаемым. В случае неадекватных результатов контролей определение резус-принадлежности следует повторить с использованием другого реагента или образца желатина. Если желатин вызывает сам по себе агглютинацию исследуемых эритроцитов, то можно предполагать наличие на них антиэритроцитарных антител антирезус или иной специфичности (это наблюдается при гемолитической болезни новорожденных, аутоиммунной гемолитической анемии и некоторых инфекционных заболеваниях). В этом случае кровь должна быть направлена на исследование в специальную серологическую лабораторию.