Применение стволовых клеток для улучшения восстановления после инсульта

Применение стволовых клеток для  улучшения восстановления после  инсульта:

 обзор

 

Tim England1, Paul Martin2, и Philip M.W.Bath1*

 Оригинальная версия статьи на английском языке:

 England Т., Martin P., Bath P.M.W. Stem cells for enhancing recovery after stroke: a review. International Journal of Stroke 2009, Vol 4, Issue 2, pp. 101-110

 

 

Возможные применения стволовых клеток чрезвычайно  многообразны, и разработка их применения при ишемическом инсульте все  еще находится в периоде младенчества. Вопрос о доступе к стволовым клеткам для исследований остается спорным, однако стволовые клетки могут быть получены как от животных, так и от человека. Несмотря на ограниченность понимания механизмов их действия, клинические исследования, оценивающие применение стволовых клеток при инсульте у человека, уже проводились. Выполняются также исследования, оценивающие применение гемопоэтических прекурсоров, мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, подхода, который предоставит аутологичные средства для применения стволовых клеток в лечебных целях. В данном обзоре резюмированы современные знания о стволовых клетках и их возможностях для содействия восстановлению после инсульта.

 

Ключевые  слова: гранулоцитарный колониестимулирую- щий фактор, ишемический инсульт, стволовые клетки.

 

Введение

 

Инсульт - третья ведущая причина смерти в мире; он приводит к разрушительным последствиям как для больных, так и для  ухаживающих за ними лиц. Более половины выживших после инсульта больных  оказываются зависимыми от окружающих в повседневной активности [1]. Ежегодно в Соединенном Королевстве возникают 110 тыс. первичных и 30 тыс. повторных инсультов; 10 тыс. случаев инсульта возникают у лиц моложе 65 лет; 60 тыс. людей умирают от инсульта. Более 5% ресурсов Национальной системы здравоохранения Соединенного Королевства (NHS) и социальных служб расходуются на больных с инсультом [2]. Поиски эффективного вмешательства для преодоления этого бремени, которое присутствует во всем мире, оказались трудной задачей: ацетилсалициловая кислота может быть широко применена, но лишь умеренно эффективна, тогда как альтеплазе высоко эффективна, но не может быть широко применена; лечение антикоагулянтами оказалось неэффективным [3], а разнообразные подходы нейропротекции продолжают исследоваться [4]. Фактически, за исключением ацетилсалициловой кислоты, тромболитической терапии и гемикраниэктомии, в остальном клиническое ведение основывается на уходе и оказании поддерживающей помощи в специализированном инсультном отделении [5-7].

 

Одна возможно важная область для исследований лечения инсульта - применение стволовых клеток для улучшения восстановления. Определения понятия "стволовая клетка" эволюционируют по мере появления новых знаний по данной тематике. В настоящее время стволовой считают клетку, обладающую двумя отличительными свойствами: способностью к самообновлению и способностью дифференцироваться в клетки многих типов (по- тентность) [8]. Клетка-прогенитор также обладает этими характеристиками, но имеет более ограниченные возможности, а именно может дифференцироваться в клетки лишь ограниченного числа типов и имеет ограниченную способность к самообновлению [8]. В настоящее время проводятся исследования применения стволовых клеток при таких состояниях как диабет, рак, нейродегенератив- ные заболевания (например, болезнь Паркинсона), заболевания сердца [9-12]. В данном обзоре рассматривается современное положение дел с применением стволовых клеток при ишемическом инсульте, с уделением особого внимания гемопоэтическим стволовым клеткам (ГСК).

 

 

 

Источники стволовых клеток для  лечения при инсульте

 

Вопреки широко распространенному  представлению о том, что "головной мозг не регенерирует", сейчас получила широкое признание возможность  спонтанного  постнатального (во взрослом возрасте) нейрогенеза [13]. Для трансплантации стволовых клеток доступны несколько источников клеток, которые могут быть подразделены на основании нескольких характеристик: экзогенный или эндогенный источник клеток; клетки по­лучены из эмбрионального, фетального или взрослого организма; нервная или ненервная природа клеток; плюри- потентность (способность к неограниченному делению) или мультипотентность (в обычных условиях регенерация только в клетки "собственной ткани", но наличие способности трансдифференциации в клетки других тканей).

 

 

 

 

 

Нервная клетка прогенитор (НКП)

 

В головном мозге как человека, так и животных имеются многочисленные участки продолжающегося образования  нейронов и клеток глии. У человека нервные стволовые клетки находятся  в перивентрикулярных участках и коре мозга на протяжении развития, и было показано, что они сохраняются и во взрослом возрасте в ряде участков, в частности - зубчатой извилине гиппокампа, черной субстанции, обонятельной луковице [13-17]. В исследованиях с применением животных моделей было показано, что ишемический инсульт сопровождается дифференциацией клеток в нейроны, фенотипически сходные с теми, кото­рые были утрачены в зоне ишемического повреждения [18], и это свидетельствует о способности мозга взрослых особей к самозаживлению. Как было отмечено у грызунов, клетки из субвентрикулярной зоны и гиппокампа головного мозга взрослого человека могут развиваться in vitro, дифференцироваться во всех трех направлениях (нейро- нальном, астроцитарном, олигодендроглиальном) [19], и, будучи введенными внутривенно при моделировании инсульта у крыс могут улучшить функциональное восстановление [20]. При введении фетальных нервных стволовых клеток человека крысам с инсультом были получены противоречивые результаты [21]; хотя клетки мигрировали через поврежденный стриатум, в ядре трансплантата оставались недифференцированные клетки и незрелые клетки нервного направления развития. Пересаженные клетки не дифференцировались в астроциты и олигоден- дроциты. Однако до настоящего времени нет набора маркеров, которые позволяли бы точно идентифицировать нервную стволовую клетку и отличить ее от других более ограниченных прогениторов, прекурсоров или дифференцированных клеток. Продолжаются исследования по выделению истинных нервных стволовых клеток и зон, в которых они существуют. Например, культивированные клетки из областей вне стриарной субвентрикулярной зоны в постнатальном мозге имеют более ограниченные способности к самообновлению, чем детально охарактеризованные нервные стволовые клетки из субэпенди- мальной зоны желудочков [22]. Для формального отождествления клеток как нервных стволовых клеток все еще необходимо функциональное проявление мультипотен- тности, самообновления и долговечности.

 

Эмбриональные и фетальные1 стволовые  клетки

 

У страдающих болезнью Паркинсона лиц отмечалось благоприятное действие после трансплантации фетальных стволовых клеток человека [11], однако возможности поставки этих клеток ограничены, а их применение сопряжено с трудностями этического характера, присущими добыче человеческой фетальной ткани в целях получения стволовых клеток. Эмбриональные стволовые клетки способны вырабатывать большие количества нервных клеток прогениторов и, в принципе, плюрипотентны с неограниченной способностью к размножению и росту; было обнаружено, что мышиные эмбриональные стволовые клетки, будучи пересаженными крысам с инсультом, способны дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки [23, 24] и выживают на протяжении до 12 недель. Возможное препятствие заключается в том, что они склонны развиваться в разнородную смесь нервных прекурсоров и дифференцированных нейронов или глиальных и остаточных стволовых клеток и небольшого числа ненервных клеток [25]; здесь трудность заключается в том, чтобы направить дифференциацию к образованию гомогенной популяции клеток. Другой недостаток заключается в их способности к злокачественной трансформации. Например, когда недифференцированные мышиные эмбриональные стволовые клетки были ксенотрансплантированы крысам, у которых был моделирован инсульт, была отмечена нейрональная дифференциация; но когда те же клетки были трансплантированы в гомологичный мышиный мозг, клетки не мигрировали и образовали высокозлокачественную тератокарциному [26].

 

Свиные фетальные клетки

 

Больным с болезнью Паркинсона и  болезнью Хантингтона выполнялась трансплантация нейронов плода свиньи [27, 28], и этот донорский источник расценен как относительно безопасный. Однако введение инородных клеток сопряжено с риском отторжения и необходимостью в хроническом подавлении иммунитета. Более того, ксенотрансплантация может привести к передаче свиных вирусов, таких как свиной эндогенный ретровирус, хотя одно исследование не выявило существования такой проблемы [29].

 

Иммортализированные2 клеточные линии

 

Клетки, полученные либо путем генетической трансформации, либо культивированием эмбриональной и взрослой ткани, представляют готовый и неограниченный источник клеток, и таким образом сглаживают острые этические вопросы в отношении получения абортной фетальной ткани. Например, клетки LBS-Neurones (Layton Bioscience Inc., Sunnyvale, CA, USA) были получены из линии человеческих клеток прекурсоров NT2/D1, с индукцией дифференциации в нейроны добавлением ретиноевой кислоты. Эта клеточная линия была изначально получена из опухоли яичка человека более 20 лет назад [30], а окончательный продукт представлял собой популяцию нервных клеток, практически неотличимых от терминально дифференцированных постмитотических нейронов [31]. Основное опасение в связи с применением такого подхода связано с возможностью злокачественного перерождения после лечебной трансплантации клеток такого типа.

 

Стволовые клетки, полученные из крови  и костного мозга

 

Стромальные клетки костного мозга, стволовые  клетки пуповинной крови и стволовые  клетки периферической крови (СКПК) являются альтернативными источниками стволовых клеток, и их применение не сопряжено с существенными этическими трудностями, если их транс­плантация выполняется в аутологичном порядке. Костный мозг и пуповинная кровь состоят из клеток многих видов, включая гемопоэтические и эндотелиальные прекурсоры (клетки CD34') и негемопоэтические клетки (мезенхимальные стромальные или CD34" клетки). При­близительно 10-20% костномозговых стволовых клеток (КМСК) мультипотентны, а остальные - представляют более дифференцированные коммитированные (с предопределенным путем дифференцирования) клетки [32]. Остается спорным, могут ли эти последние клетки тран- сдифференцироваться в нервные клетки; клетки из костного мозга могут принимать характеристики нервных клеток [33-35], но клетки атипичны (сферические по природе, с малочисленными отростками) [36], и дискутируется возможность того, что трансплантированные клетки спонтанно сливаются с клетками реципиента и принимают их фенотип [37]. Вдобавок к этому, было показано, что у мышиных ГСК с возрастом снижается способность к самообновлению, усиливается апоптоз, и в условиях стресса нарастает функциональное истощение [38]. Тем не менее, введение КМСК улучшало исходы в экспериментальных моделях инсульта [39, 40]. Было отмечено также сохранение познавательных функций при внутривенной трансплантации мезэнхимальных стволовых клеток (МСК) крысам при моделировании окклюзии средней мозговой артерии [41]. Аналогичным образом, было отмечено улучшение поведенческих и неврологических функций при внутривенном введении клеток CD133+ крысам с инсультом [42]; маркер стволовых клеток  CD 133 - трансмембранный поверхностный клеточный антиген - специфично экспрессируется на 30-75% клеток CD34' и может быть полезен при трансплантации стволовых клеток, поскольку они менее дифференцированы. Однако в этом конкретном иссле­довании [42] улучшение поведения обнаруживалось только при применении внутривенной трансплантации не позже чем через 1 час после инсульта, а уменьшение размера мозгового инфаркта отмечалось только после внутримозговой трансплантации клеток.

 

Гемопоэтические стволовые клетки (клетки CD34)

 

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - стволовые клетки взрослого (происхождение  которых недостаточно изучено), которые  дают начало клеткам крови всех типов, включая миелоидные и лимфоидные. Молекула CD34 - поверхностный клеточный гликопротеин, экс- прессируемый на ГСК и используемый для облегчения их идентификации, хотя возможно существование и ГСК CD34" [43]. Ишемический инсульт приводит к мобилизации клеток CD34* (что отмечается также и при инфаркте миокарда [44]), всплески которой отмечаются на протяжении первых 10 дней после инсульта [45, 46]; более высокие уровни мобилизации клеток CD34+ сопровождаются лучшими неврологическими исходами [45]. Источник и судьба этих клеток неизвестны. Интересно, что число циркулирующих клеток CD34+ обратно связано с риском последующего рецидива инфаркта головного мозга [47] и сердечно-сосудистых событий [48]. Принимая во внимание эти изменения, есть основания полагать что содействие мобилизации клеток CD34* может оказывать благоприятное лечебное действие. В одном недавнем исследовании мононуклеарные клетки были выделены из периферической крови 30 больных с острым инсультом и культивировались ex vivo [49]. Эти выращенные вне организма клетки представляли разнородную популяцию клеток с эндотелиальной и нейро- нальной морфологией; выращенные вне организма нейрональные клетки, будучи трансплантированными в головной мозг крысы через 4 дня после ишемии, выживали (на протяжении более 6 мес.), дифференцировались в нейрональные фенотипы, и способствовали улучшению функционального восстановления.

 

Мобилизация стволовых клеток

 

Выработка стволовых клеток, производных  из костного мозга, стимулируется гормонами, называемыми колони- естимулирующими  факторами (КСФ). Стволовокле- точный фактор (СКФ) управляет дифференциацией стволовых клеток CD34+; гранулоцитарный колониести- мулирующий фактор (Г-КСФ) - нейтрофилов; эритропо- этин - эритроцитов; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - макрофагов и нейтрофилов; макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-КСФ и КСФ-1) - моноцитов; тром- бопоэтин - тромбоцитов. СКФ, Г-КСФ, эритропоэтин, ГМ-КСФ, М-КСФ были изучены в доклинических моделях ишемического инсульта [50-54]. В настоящее время выполняются клинические исследования применения Г-КСФ и эритропоэтина при инсульте у человека.

 

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

 

Преднамеренное привлечение гемопоэтических  стволовых клеток CD34* из костного мозга  в периферическую кровь под действием Г-КСФ - клинический процесс, названный мобилизацией СКПК. Хотя механизм этого процесса в значительной мере неизвестен, Г-КСФ в отдельности или в сочетании с химиотерапией рутинно применяется в клинической практике для сокращения продолжительности нейтропении у больных с гематологическими заболеваниями, или для мобилизации и извлечения СКПК с целью последующей аутологичной или ал- логенной инфузии. Его применение при инсульте - ново, и в настоящее время исследуется как у животных, так и у человека. В лечебных целях могут быть получены аутоло- гичные стволовые клетки костного мозга, однако такой подход малопривлекателен, принимая во внимание необходимость в многократных костномозговых пункциях.

 

В моделях ишемического инсульта у  крыс и мышей несколькими исследовательскими группами было показано, что Г-КСФ оказывает нейрозащитное действие в различных дозах [55], при выполнении тромболизиса [56, 57]; улучшает функциональное восстановление [52, 58], способствует ангиогенезу [58-60] и нейрогенезу [58, 60, 61]. Всеми группами было показано, что Г-КСФ уменьшает объем повреждения при инсульте. Однако Г-КСФ может приводить к нарушению поведенческих функций [62], и может не оказывать благоприятного действия, будучи введенным в хронической фазе инсульта [63] или в моделях глобальной ишемии [64].

 

Действие Г-КСФ, вероятно, осуществляется посредством нескольких механизмов. Ангиогенез и нейрогенез могут быть активированы посредством мобилизации  клеток CD34+, но дальнейшее изучение эффектов Г-КСФ выявило, что нейроны и нервные стволовые клетки взрослых экспрессируют рецепторы Г-КСФ, и эта экспрессия индуцируется ишемией [61]. Доклинические исследования показали, что Г-КСФ может играть противовоспалительную роль, поскольку вызывает угнетение индуцируемой синтетазы оксида азота (iNOS) [65] и других воспалительных медиаторов, таких как интерлейкин-1 [66]. Полагают, что нейрозащитное действие Г-КСФ осуществляется за счет анти-апоптоти- ческой активности посредством перенастройки на более высокий уровень активности Stat 3 (signal transducer and activator of transcription 3 - преобразователь сигнала и активатор тракнскрипции) и сигнального пути JAK/STAT [65].