Применение стволовых клеток для улучшения восстановления после инсульта

 

 

 

Механизмы восстановления после инсульта

 

Нарушения двигательных, чувствительных и познавательных функций являются частым результатом инсульта и обусловливают выраженные нарушения функциональной состоятельности и социальную стесненность. Восстановление движений и двигательных функций представляет фокус реабилитации, основанной на физической терапии. Восстановление двигательных и познавательных функций достигается в разной мере посредством ряда механизмов [67-71]:

 

•    Демаскирование (проявление) - вовлечение существующих, но латентных  связей;

 

•    Спраутинг (ветвление, формирование отростков) - формирование новых нервных связей (включая синаптогенез);

 

•    Долгосрочное потенцирование - активация памяти и обучения;

 

•    Разрешение диасхиза (отдаленного  функционального угнетения);

 

•    Нейрогенез - замещение  утраченных нейронов.

 

В дополнение к этому, при моделировании у животных восстановления функций после инсульта было обнаружено, что повторная практика или упражнения могут вызвать эндогенный нейрогенез и экспрессию сигнальных молекул (которые, возможно, лучше называть "регенокины"), таких как мозговой нейротрофический фактор (МНТФ), который затем стимулирует нейрональ- ную починку, улучшая обучение и память [72].

 

Растет интерес к применению вмешательств, которые могут усиливать  нормальные восстановительные явления  после инсульта - либо фармакологически (такими лекарственными средствами, как амфетамин ("реабилитационная фармакология") [73]), либо с недавних пор - применением стволовых клеток. Успехи в молекулярной биологии создают возможности для применения клеточной терапии с целью усиления регенерации нейронов в дополнение к программе нейрореабилитации. Однако механизмы, посредством которых стволовые клетки могут улучшать восстановление, все еще недостаточно понятны. Существуют две теории:

 

•    Нейропротекция (нейрозащита) - предотвращение гибели подвергшихся повреждающему воздействию нейронов в острой фазе ишемии головного мозга;

 

•    Нейрорепарация (нейрозаживление) - "починка" поврежденных нейрональных сетей в хронической фазе ишемии головного мозга.

 

При рассмотрении того, как стволовые  клетки содействуют восстановлению, можно полагать, что эти два механизма в определенной мере перекрывают друг друга.

 

Уменьшение апоптоза и воспаления

 

Вмешательство, уменьшающее размер повреждения при инсульте, обычно - уменьшением гибели нейронов в  области ишемической полутени, свидетельствует о ней- розащитной активности. Реализация этого механизма была показана при введении ГСК и внутримозговой трансплантации человеческой нервной стволовой клетки в моделях ишемического инсульта [74, 75]. Однако уменьшение размера повреждения не всегда отмечается при трансплантации стволовых клеток, полученных из разных источников [39, 76-78], что может быть обуслов­лено различиями в методах и моментах времени выполнения трансплантации после инсульта.

 

Нейропротекция может быть также  опосредована ослаблением воспалительного ответа. Вероятно, что стволовые клетки играют центральную роль в управлении воспалительным каскадом, посредством выработки ци- токинов и факторов роста, и можно ожидать, что транс­плантация клеток вызывает или усугубляет воспаление. Усугубление воспалительного ответа в окружающей инфаркт области было выявлено в модели инсульта у мышей с лечением Г-КСФ [62]. Напротив, введение клеток пуповинной крови человека в крысиной модели вызывало обратное действие, уменьшая воспалительный инфильтрат, о чем судили на основании уменьшения экспрессии провоспалительных цитокинов [79].

 

Привлечение эндогенных нервных клеток прогениторов

 

Существование клеток прогениторов в  головном мозге и возможность  обновления нейронов, глиальных и  сосудистых клеток дают основание полагать, что после инсульта возможен существенный нейрогенез. Хотя эндогенный нейрогенез при сосудистых заболеваниях головного мозга изучался во многих моделях у грызунов [80-82], у людей было выполнено лишь несколько исследований. В одном из них гистологическое исследование было выполнено у больного 84 лет, перенесшего инсульт за неделю до смерти [83]. При использовании метки нервных стволовых клеток, вокруг области инфаркта были выявлены многочисленные нервные стволовые клетки, иммуноположительные в отношении сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) клетки, новые кровеносные сосуды, что свидетельствовало о наличии вызванного ишемией привлечения нервных клеток прогениторов (НКП) и неоваскуляризации. Другое исследование также показало наличие вызванного ишемией эндогенного нейрогенеза [18].

 

Факторы роста, такие как МНТФ и  фактор роста нервов, вовлечены в  управление делением и дифференциацией  мозговых стволовых клеток. Усиление влияния этих естественных нейрогенных  факторов путем экзогенного введения может оказаться эффективным лечебным подходом при инсульте. Однако до настоящего времени была изучена лишь одна молекула: в исследовании фазы II/III (286 больных) основного фиброблас- тного фактора роста лечение оказалось неэффективным (выявлена даже тенденция к ухудшению) и вызывало лейкоцитоз и гипотензию [84]. Эффективность лечебных подходов, воздействующих на физиологический механизм, управляемый единственным ростовым фактором, может быть ограниченной, как это было отмечено при изучении многих потенциальных нейропротекторов с единственным механизмом действия [85]. Стволовые клетки оказывают действие посредством нескольких механизмов, в частности - привлекая эндогенные клетки прогениторы посредством секреции факторов роста.

 

Нейрогенез

 

Остается неясным, могут ли стволовые  клетки улучшать восстановление путем  репликации и дифференциации ("прямой нейрогенез"), и таким образом - замещения поврежденных клеток мозга  и воссоздания нервных сетей; данные по этому вопросу ограничены и противоречивы. У крыс с индуцированной окклюзией средней мозговой артерии трансплантированные нейросферы оставались живыми через 4 недели после трансплантации, и большинство мигрировавших клеток экспрессировали нейро- нальный фенотип (включая маркеры даблкортин3, р-тубу- лин, глиальный фибриллярный кислый белок) [76]. Нейросферы, выделенные от взрослых крыс с инсультом, также могут дифференцироваться в клетки глии (как и нейроны), и могут мигрировать в направлении ишемического повреждения [86]. Линия человеческих нервных стволовых клеток (СТХ0Е03, ReNeuron Group pic. [87]), выведенная из человеческих соматических стволовых клеток после генетической модификации иммортализирую- щим геном, может дифференцироваться в нейроны и аст- роциты, и в модели инсульта у крыс (окклюзией средней мозговой артерии) приводит к существенному улучшению как сенсомоторной функции, так и моторной функции в целом, через 6-12 недель после имплантации [88]. Наконец, у мышей, неспособных к развитию клеток мие- лоидного и лимфоидного рядов, трансплантированные клетки костного мозга (ККМ) мигрировали в головной мозг и экспрессировали специфичные для нейронов антигены (NeuN-ядерный белок, который обнаруживается исключительно в нейронах) [34]. В противоположность этому, в другом исследовании, в котором выполнялась трансплантация ККМ мышам, не было обнаружено признаков клеток, подобных нервным [89]. Другим группам исследователей также не удалось выявить дифференциации ГСК в клетки нервной ткани [90]. Фактически, в исследованиях с положительными результатами, показавших дифференциацию клеток с формированием нервного фенотипа, выживание лишь небольшого числа клеток свидетельствовало о том, что интеграция в нервные сети хозяина не является единственным или основным механизмом действия, улучшающим функциональное восстановление. Тем не менее, обнаружение того, что ответ может зависеть от числа введенных клеток ("зависимость ответа от дозы") согласуется с благоприятными эффектами, опосредуемыми замещением клеток [91].

 

Ангиогенез

 

Нейрогенез сам по себе не приведет к восстановлению, поскольку нейронам нужна обеспечиваемая сосудами питательная поддержка, и потому необходимо образование новых сосудов. Наличие ангиогенеза было обнаружено экспериментально, когда при внутривенном введении костномозговых CD34' клеток мышам через 48 часов после индукции инсульта отмечалось ускорение образования новых сосудов в сравнении с мышами, которым вводились CD34 клетки [74]. Более того, введение антиангио- генного средства предотвращало благоприятное действие прекурсоров CD34* [74].Хотя ангиогенез может отражать дифференцирование ГСК в клетки стенок кровеносных сосудов, вероятно наличие также непрямого действия, поскольку было показано, что человеческие CD34+ клетки вырабатывают многочисленные ангиогенные факторы, в том числе СЭФР и инсулиноподобный фактор роста (ИФР-1) [92]. Таким образом, богатое сосудистое окруже­ние, опосредуемое CD34+ клетками, может способствовать последующей нейрональной регенерации.

 

Пластичность

 

Нейропластичностью называют организационные  изменения в головном мозге, в результате которых отдельные нейроны или их сети адаптируют свои функции. Эта теория составляет основу целенаправленной терапевтической реабилитации. Стволовые клетки могут усиливать этот процесс посредством различных механизмов восстановления, включая спраутинг и демаскирование, однако данные в поддержку роли этих механизмов при инсульте остаются ограниченными. При экспериментальном инсульте спраутинг был обнаружен после внутривенного введения клеток стромы костного мозга человека крысам: отмечено уменьшение объема повреждения на 50% по сравнению с животными контрольной группы, которым был введен изотонический раствор хлорида натрия [93]. В противоположность этому, в одном из нескольких исследований с отрицательными результатами введение клеток пуповин- ной крови человека не улучшило сенсомоторный или познавательный исход у крыс с инсультом [78].

 

Миграция стволовых клеток

 

В нескольких экспериментальных исследованиях  изучалась судьба стволовых клеток, которые не были имплантированы непосредственно в место повреждения. В условиях ишемии трансплантированные стромальные клетки костного мозга избирательно мигрировали в ишемизирован- ное полушарие поврежденного головного мозга крыс [94], что свидетельствовало о возможности избирательного привлечения этих клеток поврежденным мозгом. В одном исследовании культивируемые эмбриональные клетки (клеточной линии D3) инкубировались с супер-парамаг- нитными наночастицами окиси железа (что делало их ви­димыми при магниторезонансной визуализации) и затем были трансплантированы в нормальное полушарие крыс, перенесших за 14 дней до этого преходящую ишемию в бассейне средней мозговой артерии. Контраст отслеживали с применением Т2*-взвешенной MPT, которая высокочувствительна к "железной метке", и было отмечено, что за 3-7 дней он мигрировал в подвергшееся ишемии полушарие и оставался там, по крайней мере в течение 20 дней после имплантации [95]. В другом исследовании Г-КСФ вводили здоровым донорам (людям) для мобилизации СКПК. CD34* клетки извлекали, отделяли иммуномагнит- ным методом и маркировали [96]. Эти клетки затем вводили в здоровое полушарие крысам, которые за 7 дней до этого подверглись окклюзии средней мозговой артерии. Клетки отслеживали методом Т2"-магниторезонансной визуализации. Было обнаружено, что они мигрировали в поврежденное полушарие о оставались там на протяжении, по крайней мере, 21-50 дней [96]. Более того, в последующем при иммоногистохимическом исследовании человеческие клетки обнаруживались в области повреждения, в мозолистом теле и субвентрикулярной области. Сохраняется неопределенность в отношении процессов, лежащих в основе миграции стволовых клеток, хотя некоторые посягательства на ее преодоление все же предприняты. Например, оказалось, что стромальноклеточный фактор 1а (СФ-1а) и рецептор CXCR4 играют важную роль в миграции трансплантированных внутривенно МСК [97].

 

Клинические исследования трансплантации стволовых  клеток после инсульта

 

Крупномасштабных  исследований трансплантации стволовых  клеток при инсульте выполнено не было, однако опубликованы результаты нескольких исследований безопасности (табл. 1).

 

В одном  неконтролированном исследовании культивированные нейрональные клетки, полученные из иммор- тализированной клеточной линии (LBS-Neurones), были трансплантированы 12 больным (возраст 44-75 лет) с инсультом (преимущественно с вовлечением базальных ганглиев) [98]. Больные получили по одной или две дозы клеток посредством КТ-направляемой стереотаксичес- кой имплантации. Иммуносуппрессорное прикрытие было осуществлено внутривенным введением метил- преднизолона (в ходе операции), и затем – введением циклоспорина на протяжении 8 недель. Хотя функциональные исходы не могли быть оценены, поскольку исследование было слишком малым для такой оценки и не имело контрольной группы, выполненное у 6 больных ПЭТ-сканирование выявило повышение метаболической активности, что свидетельствовало либо о повышении жизнеспособности клеток, либо о присутствии воспалительных клеток [98]. Интересно, что детальное патогистологическое исследование головного мозга одного из участвовавших в исследовании больных, умершего через 27 мес. после имплантации клеток, выявило выживание трансплантированных нейрональных клеток без проявлений злокачественности [99]. Возможность де- дифференциации трансплантированных клеток назад к злокачественному состоянию является одним из теоретических опасений при применении трансформированных стволовых клеток, полученных из опухолевых, хотя доклинические исследования введения клеток этой линии (NT2) мышам не выявили токсичности или способности стимулировать опухолевый рос [100].

 

В рамках продолжения  этого исследования авторы провели  рандомизированное исследование II фазы, используя эту же клеточную  линию, у 18 больных [101]. В исследование включали больных в возрасте от 18 до 75 лет с фиксированным двигательным дефицитом, который оставался неизменным на протяжении не менее 2 мес. В группе больных, подвергавшихся лечению (п=14) выполнялось 1 или 2 введения клеток и реабилитационное лечение; в контрольной группе (п=4) проводилось только реабилитационное лечение. Основная мера исхода - оценка по двигательной части Европейской шкалы инсульта (European Stroke Scale motor score) через 6 мес. - не различалась между группами [101].

 

Недавно было выполнено также исследование безопасности и осуществимости применения фетальных свиных клеток у больных через 1,5-10 лет после инфаркта в бассейне средней мозговой артерии (с поражением стриату- ма) [102]. Для предотвращения отторжения клетки подвергали предварительному воздействию анти-МНС-Г антител, и иммуносуппрессорные лекарственные средства больным не вводились. Хотя планировалось включение в исследование 12 больных, были включены только 5, после чего Администрация по пищевым продуктам и лекарственным средствам (FDA) досрочно остановила исследование, поскольку у 2 больных развились серьезные неблагоприятные явления. У одного больного наступила окклюзия корковой вены вследствие хирургического вмешательства, а у второго - генерализованные и парциальные эпилептические припадки на фоне гипергликемии. Эти наблюдения обращают внимание на возможные риски при внутричерепной трансплантации стволовых клеток и указывают на необходимость поиска других моделей введения стволовых клеток.

 

Один из таких альтернативных путей заключается  в применении аутологичных стволовых клеток. Недавно в рандомизированном контролированном исследовании оценивалось применение МСК у больных с инфарктом в бассейне средней мозговой артерии [103]. Пять больных со стойким неврологическим дефицитом, сохранявшимся через 7 дней после ишемического инсульта, были включены в группу внутривенного введения МСК, и 25 больных - в контрольную группу (в которой не выполнялись никакие дополнительные вмешательства, в том числе - ложное вмешательство трансплантации). МСК были получены из аспиратов костного мозга и затем культивировались ех vivo для добычи достаточных количеств клеток, которые затем вводились больному через 4-6 нед. и через 7-9 нед. после возникновения симптомов инсульта. Через 1 год 10 больных из контрольной группы выбыли из поля зрения исследователей, однако серьезных неблагоприятных явлений - таких как инфекционные осложнения или формирование опухолей - отмечено не было. Это исследование показало выполнимость лечебного подхода, заключающегося во введении культивированных ex vivo МСК, однако авторы подверглись жесткой критике как за использованные ими методы, так и за сформулированные ими выводы [104] и принесли извинения за допущенный ими плагиат в написании обсуждения своих результатов [105].

 

 

 

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в клинике инсульта

 

Три небольших рандомизированных  контролированных исследования оценили  безопасность рекомбинантного гра- нулоцитарного колониестимулирующего  фактора (Г-КСФ) после ишемического инсульта (табл. 2). Недавно завершенное исследование II фазы с приращением дозы оценивало применение Г-КСФ у 36 больных (Г-КСФ - п=24, плацебо - п=12) с ишемическим инсультом в подостром периоде [ 106]. Лечение проводили в промежуток времени от 7 по 30 дни после инсульта подкожным введением Г-КСФ в нарастающих дозах (1-10 мкг/кг либо однократно, либо ежедневно на протяжении 5 дней). Введение Г-КСФ сопровождалось зависимым от дозы повышением числа CD34+ клеток (измерение поточной цитометрией) до 10-кратного уровня, с достижением пикового уровня на 5-й день. Были отмечены также зависимое от дозы повышение числа лейкоцитов на 3-й день и снижение числа тромбоцитов, чего и следовало ожидать при применении Г-КСФ. Частота серьезных неблагоприятных явлений не различалась между группами, хотя частота инфекционных осложнений была недостоверно выше в группе больных, получавших Г-КСФ (29% в сравнении с 25%); частота рецидивирования инсульта не различалась между сравниваемыми группами.

 

Во втором исследовании 10 больных с оценками по шкале тяжести инсульта Национальных институтов здоровья (NIHSS) в пределах от 9 до 20 и не позже 7 дней после инсульта были рандомизированы в группы 5-дневного лечения Г-КСФ (15 мкг/кг в сутки, п=7) и контрольную (рутинные лечение и уход, п=3) [107]. При последующем наблюдении на протяжении 12 мес. у больных, получавших Г-КСФ, было достигнуто существенно более выраженное улучшение неврологических функций и уменьшение функциональной несостоятельности, чем у больных контрольной группы. Не было отмечено усугубления симптомов инсульта и тромботических осложнений. К сожалению, следует отметить предвзятость результатов, поскольку у многих больных, которым проводилось лечение Г-КСФ, имел место лакунарный инфаркт, т.е. вариант инсульта, при котором улучшение часто наступает спонтанно.