Автор работы: Пользователь скрыл имя, 10 Января 2013 в 22:21, курсовая работа
ВСТУП
Актуальність обраної теми полягає в перспективності розробки протипухлинних вакцин для лікування та попередження онкологічних захворювань. Сучасний темп життя вимагає високої опірності організму до захворювань, збереження його функціональних можливостей. Шкідливий вплив зовнішнього середовища, нехтування важливістю ведення здорового способу життя та порушення клітинних процесів зумовлюють появу та можуть провокувати розвиток онкологічного захворювання.
ГМ-КСФ. Дослідження свідчать про значну ефективність цих вакцин по відношенню до онкологічної хвороби сечового міхура. Спосіб отримання ефективної векторної вакцини є достатньо трудоємким та не завжди ефективним з таких причин:
Це можна вирішити за допомогою вакцинування на основі білків теплового шоку, гангліозидів, синтетичних пептидів і ДК, у тому числі геномодифікованих.
Вакцини на основі білків теплового шоку, гангліозидів, пептидів. Білки теплового шоку мають можливість генерувати протипухлинну імунну відповідь, відзначаються стійкістю внутрішньоклітинних молекул, які мають потенційно імуногенні пептиди. Білки теплового шоку здатні з'єднуватись з поверхневими структурами АПК, піддаватися ендоцитозу і виявленню імуногенності у поєднанні з МНС-молекулами класу І та цитоксичними Т-клітинами. З видаленої пухлини виокремлюють білки теплового шоку та вводять підшкірно. Цей метод є безпечним і відкриває можливість для індукції протипухлинної імунної відповіді. На даному етапі розвитку медицини та імунотерапії приорітетними є спроби викликати реакцію комбінованою ВАКК на основі рекомбінантного білка теплового шоку (HSP70) у поєднанні з тіразіназою gp100 [18, с. 181].
Вакцини, що також містять потенційно імуногенні пептиди, називаються гангліозидними. Гангліозид є гліколіпідним антигеном, що експресується на поверхні пухлинних клітин і спричинює утворення антитіл. На поверхні меланомних клітин найбільш інтенсивно експресуються гангліозиди, що містять і нейтральний цукор, і сіалову кислоту. Відомими гангліозидами є GM3, GD3, GD2, GM2 і O-ацетил GD3. GM2 є найбільш імуногенним меланомним гангліозидом. Між наявністю в сироватці онкологічних хворих антитіл GM2 і збільшенням безрецидивної і загальної виживаності існує прямий зв’язок. Утворення GM2 IgM було виявлено у 85% хворих, що знаходилися на етапі лікування. Також було розроблено нову вакцину на основі GM2, що пов'язана з ад'ювантом (GМК). Процес утворення цієї форми вакцини супроводжується формуванням антитіл у 100% хворих [8, с. 459].
Ефективність GMK-вакцини оцінюється у хворих на меланому під час мультицентрованих рандомізованих досліджень у порівнянні з інтерфероном-α. Перші 16 міс. спостереження за хворими не виявляють збільшення показників безрецидивної і загальної виживаності. Однією з причин відсутності значущого лікувального ефекту є те, що гангліозид GM2 експресується на поверхні всіх меланомних клітин, але ступінь його експресії є незначним у порівнянні з іншими гангліозидами. Менше 20% клітинних ліній меланоми можуть бути піддані лізингу моноклональних антитіл до GM2 і комплементу. Тому для того, щоб одержати клінічно значущий результат необхідно індукувати утворення антитіл проти інших гангліозидів. У зв'язку з цим очевидною є доцільність застосування допоміжних полівалентних вакцин на основі декількох гангліозидів [8, с. 458].
Пептидні вакцини. Сучасні біотехнологічні методи дозволяють отримувати синтетичні пухлинноасоційовані антигенні пептиди в необхідних кількостях. Пептиди, які знаходяться під впливом імунної системи протягом декількох днів, є високоімуногенними. З цієї причини значного поширення набули дослідження інтранодального введення пептидів, в тому числі у поєднанні з костимулюючими факторами та ад'ювантами.
Одним з перших було проведено дослідження функціонування пептиду MAGEE3, що є реструкованим HLA-A1 галотипом. Лікувальний ефект у 6 з 19 хворих показав, що синтетичні пептиди є безпечним і перспективним методом вакцинотерапії. Цитоксичність Т-лімфоцітів проти клітин знаходиться в прямому кореляційному зв’язку з експресією антигену в тканинах меланоми [17, с. 95].
У хворих з прогресуванням хвороби на фоні вакцинотерапії спостерігалася втрата антигену, що дозволяє припустити можливість імуноселекціі пухлинних клонів на тлі вакцинації. Національним інститутом раку (США) проводилися дослідження з вивчення пептидів, що були отримані з меланомного дифференціюючого антигену gp100. Спочатку лікування проводилося HLA-A2 + пацієнтам за допомогою нативного пептиду, але згодом інша група хворих отримала лікування білком, в якому було змінено одну амінокислоту. Цей пептид виявляв вищу афінність по відношенню до HLA-A2 * 201, ніж нативний, що може слугувати підставою до припущення про більшу індукцію відповіді Т-лімфоцитів. Після введення ІЛ-2 до периферичної крові ці Т-лімфоцити не виявлялися, проте лікувальний ефект спостерігався, що дає змогу припускати можливість їх міграції до місця локалізації антигенів. Було проведено клінічні дослідження, в яких робили спроби вакцинувати хворих на меланому за допомогою немутованих антигенів (MAGE, BAGE, RAGE), у тому числі в комбінації з іммунологічними ад'ювантами. Вакцини на основі синтетичних пептидів є перспективним методом імунотерапії [18, с. 84].
Вакцини на основі дендритних клітин. Дендритні клітини відіграють важливу роль в процесі пухлинної прогресії. У зв’язку з відсутністю ДК на пухлині або по причині слабкої експресії молекул МНС класу I і II, а також CD80 і CD86, костимулюючих молекул на дендритній клітині ДК, що інфільтрують пухлину, не спостерігається антигенноспецифічної клітинної відповіді. Це може бути наслідком продукції злоякісних пухлиною факторів (ІЛ-10, ТФР-бета, фактора росту ендотелію та ін), що пригнічують диференціювання, дозрівання та функціональну активність периферійних ДК. При культивуванні ДК в умовах in-vitro, що дозволяють отримати їх максимальне зростання і активацію, спостерігається збільшення експресії поверхневих молекул, але їх рівень є недостатнім для посилення відповіді специфічних ЦТЛ [4, с. 366].
Найбільшу здатність до презентації специфічного пухлинного антигену Т-лімфоцітам мають аутологічні попередники ДК кісткового мозку, що були вирощені в умовах in vitro, а також синогенні та алогенні дендритні клітини периферійної крові здорових осіб. Функціонально активні ДК інкубують з антигенами, що є специфічними для пухлини (пептиди, білки, кДНК або мРНК), з метою отримання ефекту представлення пептидних фрагментів пухлиноасоційованих антигенів у поєднанні з молекулами МНС на поверхневій мембрані ДК. Потім, дендритні клітини, що вміщують в собі антиген, вводять хворому. Протипухлинний ефект досягається шляхом «обробки» і введення [4, с. 367]. Зобразимо механізм імунологічної реакції організму людини, хворої на онкологічне захворювання при введенні протипухлинної вакцини:
Рис.2. Механізм імунологічної реакції організму на введення протипухлинної вакцини
Можемо прийти до висновку, що кожен окремий вид протипухлинних вакцин відрізняється функціональною здатністю.
В 60-70-тих роках ХХ століття було доведено, що більшість пухлин характеризуються імуногенністю. Це відкриття стимулювало пошук засобу подолання онкологічної хвороби за допомогою імунної системи для руйнування пухлин. Але до появи генно-інженерних методів трансформації клітин всі спроби в цьому напрямку були марними. Проблемним момент для вирішення цієї проблеми був той факт, що цитотоксичні Т-лімфоцити не активувалися при зустрічі з онкологічними клітинами і їх специфічними антигенами і не починали секретувати цитокіни, які вони секретують при зустрічі з чужорідними антигенами.
Передумовою для створення протипухлинних вакцин стали результати експериментів, в яких вдалося попередити загибель тварин від прищеплюваних пухлин за допомогою імунізації сінгенними пухлинними клітинами або їх антигенами. Для відторгнення пухлини, що перебуває на піку свого розвитку та є значною за своїми обсягами необхідно зменшити її масу, вдаючись до хірургічних методів. Отже, слід зробити висновки про те, що клінічна ефективність вакцинації має бути найвищою після хірургічного втручання, а також при захворюванні, що характеризується малими розмірами пухлин [11, с. 176].
В деяких хворих на меланому вакцинація аутологічними пухлинними клітинами (нативними, модифікованими, змішаними з ад'ювантом) дозволяє досягти ремісії. Частотність прояву ремісій і їх незначна тривалість стимулюють необхідність реалізації досліджень в цій галузі. Слід враховувати, що перенесення генів, що кодують імуномодулятори (CD80, ІЛ-12, ГМ-КСФ) в аутологічні пухлинні клітини дозволяє підвищити їх імуногенність [2, с. 157].
Однією із стратегій боротьби з пухлинам може бути така, що спрямована на стимулювання імунної системи до впізнавання пухлинних клітин. Багато дослідників роблять спроби розвивати такий вид терапії, що базується на стратегії створення індивідуальних протипухлинних вакцин. Процес їх підготовки полягає в наступному. Клітини, що були отримані з пухлини хворого, вирощують як культуру клітин і долучають до них гени, що кодують білки-імуностимулятори. Згодом ці клітини опромінюють з метою їх інактивації та вводять пацієнтові задля виклику імунної відповіді. Вона має на меті знищити пухлинні клітини та захистити пацієнта від виникнення пухлин даного типу. Такі дії ґрунтуються на гіпотезі про те, що підвищення концентрації цитокінів у безпосередній близькості до пухлинних клітин може стимулювати імунну відповідь найближчих Т-клітин.
Перші досліди по виявленню впливу протипухлинних вакцин були на мишах. Клітини пухлин трансформували генами таких імуномодуляторів, як цитокіни: IL1 #, IL-2, IL-4, IL-6, TNF #, GM-CSF, гамма-інтерферон. Було виявлено, що пухлини тварин, яким вводили модифіковані таким чином клітини цієї ж пухлини, зменшували тем розвитку або гинули. Більш того в багатьох випадках тварини, що отримали дозу таких трансдукованих клітин, ставали несприйнятливими до розвитку пухлин при введенні пухлинних нетрансдукованних клітин. Тобто трансдукція клітин діє як протипухлинна вакцина [2, с. 158].
Це дало підстави розпочати дослідження на людському матеріалі. Першою спробою була активація генів імуностимуляторів за допомогою ретровірусних векторів клітини меланоми, карцином, нейробластоми, раку грудей. С. Тревіс є представником іншого підходу в індивідуальній імунотерапії пухлин. Він базувався на такому механізмі пухлинної активації. Клітини меланоми мають специфічні пухлинні антигени у вигляді пептидів, експонованих на поверхню клітин у вигляді комплексів з білками головного комплексу гістиносумісності другого типу MHC1. Пухлинні антигени розпізнаються Т-кілерними клітинами або цитотоксичними Т-лімфоцитами. Раніше вважалося що для розпізнавання та забезпечення імунної реакції необхідним є лише взаємодія Т-клітинного рецептора і комплексу пептиду з МНС1. У ході досліджень цього напрямку було виявлено, що цього недостатньо. Необхідним є допоміжний активатор, що приятиме розвитку додаткових реакцій. Його прояв реалізується в взаємодії ще однієї молекули на поверхні антигеннорепрезентативних клітини, так званої поверхневої молекули В7, і молекул рецептора, що знаходиться на поверхні Т-клітин – CD28. Без додаткової взаємодії Т-клітини не можуть здійснити реакцію, що є необхідною для повноцінної імунної відповіді. Можна стверджувати, що специфічні Т-клітини не можуть розпочати процес продукції фактору росту Т-клітин, інтерлейкіну-2 та активацію проліферації без залучення з свого боку специфічних Т-клітин. Останні в свою чергу виявляють об’єкт інактивації та знищують клітини, що містять на поверхні небажаний чужорідний антиген [20, с. 328].
Основною причиною того, що пухлинні клітини не можуть розпізнатися клітинами імунної системи може бути й те, що пухлинні клітини зазвичай не містять на поверхні В7. Був проведений наступний дослід. Взяли частину клітин меланоми миші та ввели до них антиген-В7. Потім вони були долучені до організму здорової миші. В результаті спостерігали таке явище: у миші розпочався процес розвитку пухлини, проте згодом ця пухлина деградувала, і жодна з мишей, які отримали дозу клітин модифікованої меланоми, не загинула. Миші ж, що отримали немодифіковані клітини загинули. За умови, якщо мишам, що вакциновані модифікованими меланомними клітинами, ввести немодифіковані клітини меланоми, то 89% мишей виявляються захищеними від розвитку пухлини. Це означає, що вакцина могла б захищати їх від метастазування [8, с. 459].
У ході дослідження також були виявлені цікаві закономірності. Зазвичай кілерні клітини вимагають для своєї проліферації не тільки IL-2, який вони продукують самі, але й додаткового IL-2 та інших лімфокінів, що одержують як допоміжні від хелперних Т-клітин. В ситуації взаємодії з модифікованими клітинами меланоми в такому механізмі немає необхідності (не потребують допомоги).
Основні два підходи до створення генно-інженерних протипухлинних вакцин засновані на значних успіхах у розумінні механізмів клітинної імунної відповіді.
Існує й третій підхід до визначення проблеми, проте він недостатньо теоретично обґрунтований. Він базується на принципі придушення експресії специфічних для пухлинних клітин генів, які сприяють її зростанню. Більшість пухлин починають синтез великої кількості інсулін-подібного фактора росту – IGF-1. Можна зупинити експресію цього гена шляхом введення до пухлинної клітини генетичних конструкцій, що синтезують РНК комплементарну по відношенню до мРНК гену IGF-1. Така РНК може взаємодіяти з мРНК ростового фактора та перешкоджати її трансляції. Пухлини, утворені такими модифікованими клітинами, руйнуються імунною системою. Для з’ясування цього феномену активно ставляться досліди на прикладі людей [20, с. 329].
Метою застосування протипухлинної аутовакцини є виклик довготривалої імунної реакції, стримуючої розвиток пухлинного процесу. Основною проблемою, пов'язаною з досягненням цієї мети є підвищення антигенності пухлинного матеріалу з метою стимуляції імунної відповіді.
Важливим підгрунттям для продовження дослідів у цій сфері є дані про те, що об'єднання специфічного антигенного матеріалу з факторами штучного або природного походження здатні посилити імунну відповідь. До них можна віднести низькомолекулярні хімічні речовини (гаптени), що модифікують молекулу білка-антигена, або сполуки з високою молекулярною масою. До них також часто відносять компоненти мікробних клітин. Їх застосування є цілком логічним: сполуки такого типу беруть участь у формуванні протимікробного імунітету і стимулюють цитотоксичну реакцію клітин [2, с. 159].