Вич-инфекция

Ген pol кодирует 3 фермента: протеазу (р22), обратную транскриптазу (р64/53) и эндонуклеазу (р31). Эти белки образуются в результате протеолитического расщепления предшественника с молю массой 150кД. Несмотря на относительно небольшое количество этих белков в вирионе (примерно 2 молекулы на вирион), антитела к ним выявляются в сыворотках больных СПИДом. Наиболее ярко выражена реакция с р31.

sor .Tретья открытая рамка перекрывается с 3`-концом гена pol и кодирует белок с молю массой 23 кД. Антитела к этому белку удается выявить в сыворотках больных СПИДом. По-видимому, белок транслируется со сплайсированных полиаденилированных РНК размером 5500 и 5000 нуклеотидов (см. Рисунок 2). Как показали опыты с использованием инфекционной провирусной ДНК ВИЧ, мутации в области гена практически не влияли на способность вируса реплицироваться и оказывать цитопатогенное действие на CD4-клеточную линию, если не считать небольшого замедления этих процессов по сравнению с исходным вирусом. Тем не менее, высокая консервативность нуклеотидной последовательности гена sor указывает на наличие какой-то функции продукта этого гена в жизненном цикле вируса. Возможно, эта функция важна при репликации в нелимфоидных клетках, например в нервных и ретикулоэпителиальных.

env. иРНК, кодирующая белки оболочки вириона, образуется в результате сплайсинга, приводящего к удалению из геномной РНК большого интрона, содержащего гены gag, pol  и  sor (см. Рисунок 2).  Образующаяся  иРНК   размером  4300  нуклеотида

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

содержит открытую рамку с типичным инициирующим AUG, которая может направлять синтез белка, состоящего из 861 аминокислотного остатка с мол. массой 97.5 кД. Этот белок предшественник в дальнейшем обильно гликозилируется, в результате чего его мол. масса возрастает до 160 кД. Предшественник содержит 3 гидрофобные области, характерные для оболочечных белков других ретровирусов. Первый гидрофобный участок (с 17-й по 31-ю аминокислоты) соответствует сигнальному пептиду, второй находится в районе сайта протеолитического расщепления белка-предшественника, третий является частью трансмембранного белка. В результате протеолитического расщепления образуется 2 сильно гликозилированных белка: наружный белок оболочки gp120 и трансмембранный белок gp41. Интересной особенностью трансмембранного белка является наличие необычно длинной последовательности (длиной в 150 аминокислотных остатков) гидрофильных аминокислот вслед за гидрофобной частью трансмембранного белка. Эта последовательность, по-видимому, является внутриклеточным фрагментом gp41. Еще, как показали исследования, правильный процессинг gp160 происходит не во всех клеточных линиях. От чего это зависит, пока неизвестно.

3`-orf. Эта открытая рамка расположена между 8347-м и 8992-м нуклеотидами и простирается, таким образом, в U3 область 3`-LTR. Кодируемый этим геном белок имеет мол. массу 27 кД и транслируется со сплайсированной иРНК размером 1800 нуклеотидов (см. Рисунок 2).

Хотя антитела к этому белку удается выявить в крови больных СПИДом, он не является абсолютно необходимым для репликации вируса. Продукт 3`-orf оказывает влияние на цитопатогенность вируса.

tat-3. Явление трансактивации было впервые описано для ретровирусов человека HTLV-1 и HTLV-2. Белок, осуществляющий функцию трансактивации, кодируется у этих вирусов небольшой открытой рамкой, расположенной на 3`-конце генома после гена env. Механизм его действия заключается в активации транскрипции структурных генов вируса, вследствие чего ген, кодирующий белок-трансактиватор, был назван tat (transactivator of transcription).

Феномен трансактивации выражен у ВИЧ на несколько порядков сильнее, чем у HTLV-1 и HTLV-2. Как сейчас стало ясно, за этот процесс у ВИЧ отвечают по крайней мере, 2 гена: tat-3 и art (trs). Первый из них кодируется иРНК размером около 2000 нуклеотидов, образующейся в результате сложного сплайсинга (см. Рисунок 2). Механизм действия белка tat-3 у ВИЧ значительно сложнее, чем у аналогичных белков tat вирусов HTLV-1 и HTLV-2.

Продукт гена tat-3 - белок с мол. массой 14 кД, выявляемый с помощью сывороток больных СПИД. Мутации в 5`-области первого кодирующего экзона tat-3 нарушают способность вируса синтезировать структурные белки и реплицироваться. Эти мутации могут быть комплементированы в клеточных линиях, постоянно экспрессирующих tat-3 белок. Сейчас получены линии как В- так и Т-лимфоцитов, стабильно трансформированных tat-3 геном и продуцирующих белок-трансактиватор. Другие клеточные линии, например HeLa, продуцирующие функциональный tat-3 белок, также могут поддерживать размножение мутантного по tat-3 ВИЧ. Использование подобных клеточных линий и клонированных провирусных ДНК, содержащих различного размера делеции в tat-3 гене, позволило изучить механизмы действия кодируемого этим геном белка.

art (trs). Другим белком, участвующим в регуляции экспрессии структурных генов ВИЧ является продукт гена art (antirepression transactivator - антирепрессорный трансактиватор). Транслируется он, по-видимому, с иРНК, принадлежащей к тому же классу  молекул размером 2000 нуклеотидов, что и иРНКtat-3. Кодирующие экзоны гена art перекрываются экзонами tat-3 (см. Рисунок 2), а при сплайсинге используются те же акцепторные и донорные сайты. Однако при трансляции art функционирует инициаторный AUG с координатой 5500, а не 5412, как для гена tat-3. В результате, art читается со сдвигом рамки отностительно tat-3, что приводит к уменьшению ее кодирующей рамки в первом транслируемом экзоне с 214 до 76 нуклеотидов и к увеличению во втором с 44 до 271 нуклеотида. Синтезируемый белок состоит из 116 аминокислотных остатков, причем основная доля приходится на аминокислоты, проявляющие основные свойства. Подобные белки обладают сродством к нуклеиновым кислотам и часто регулируют экспрессию генов.

Действие продукта art осуществляется на посттранскрипционном уровне. По-видимому, он активирует трансляцию иРНК структурных генов gag и env, снимая действие специфических негативных регуляторов (см. ниже). Наряду с этим продукт art участвует и в регуляции сплайсинга РНК, в связи с чем для указанного гена было предложено другое название - trs (transregulator of splicing - трансрегулятор сплайсинга).

 

           РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ВИРУСНЫХ ГЕНОВ.

 

Как было отмечено выше, геном ВИЧ, помимо обычных ретровирусных генов (gag, pol, env), содержит еще ряд генов, функции которых заключаются в регуляции экспрессии синтеза структурных белков вириона. Если о функции продуктов генов sor и 3`-orf мало что известно, кроме того, что они не являются необходимыми для репликации вируса, о действии продуктов генов tat-3 и art имеется много данных, укладывающихся в определенную схему.

Первые опыты по изучению синтеза некоторых ферментов в клетках, трансформированных рекомбинантными ДНК, содержащими гены этих ферментов под контролем LTR ВИЧ, показали, что количество специфических иРНК резко увеличивается (в 100-1000 раз) после введения в клетки  дополнительно активно экспрессирующегося   tat-3 гена. Дальнейшие опыты показали, что продукт гена tat-3 увеличивает количество специфических иРНК примерно в 10 раз, причем его действие опосредовано последовательностью, присутствующей в R-элементе LTR ВИЧ. Однако для максимального эффекта tat-3-зависимой трансактивации необходимо присутствие последовательности U3 - элемента LTR. Таким образом, продукт гена tat-3 вызывает активацию транскрипции, и его активирующее действие осуществляется на этапе инициации транскрипции.

Важной частью tat-3-зависимой трансактивации является активация трансляции иРНК. Этот посттранскрипционный эффект tat-3-белка также опосредован последовательностью R-элемента LTR ВИЧ. Эта последовательность была обозначена TAR (trains acting responsive) и локализована между  -17 и +80 нуклеотидами в LTR ВИЧ. Анализ первичной нуклеотидной последовательности этого участка показал наличие там 24-х нуклеотидного обращенного повтора (между 1-м и 59-м нуклеотидами), который может формировать петлю в иРНК. Такая вторичная структура иРНК может мешать 40S субъединице рибосомы передвигаться вдоль иРНК при инициации трансляции и препятствовать, таким образом, синтезу продукта. Взаимодействие продукта гена tat-3 с этим участком иРНК релаксирует структуру и снимает, таким образом, препятствие для трансляции. В эксперименте было выяснено, что делеции в TAR участке снимали тормозящее действие R-элемента на трансляцию, однако полностью ликвидировали эффект трансактивации. Таким образом,  tat-3 кодируемый белок или индуцированные им клеточные факторы узнают TAR последовательность как в ДНК (провирус), так и в иРНК и активирует соответственно транскрипцию или трансляцию.

Действие другого гена-трансактиватора - art- осуществляется только на посттранскрипционном уровне. Продукт гена art(trs) участвует в регуляции сплайсинга. Он снимает репрессию специфических негативных регуляторов трансляции, расположенных на иРНК, кодирующей белки gag и env. В отсутствие активного гена art(trs) нарушается синтез именно этих белков, в то время как экспрессия других генов (например tat-3)  не нарушается.

Если суммировать приведенные данные, то можно предложить такую модель регуляции экспрессии генов ВИЧ. Продукт гена tat-3, взаимодействуя с TAR последовательностью в LTR провируса, активирует транскрипцию провирусной ДНК. Возможно, это происходит за счет уменьшения тормозящего действия на процесс транскрипции специфического негативного регуляторного элемента (NRE), расположенного между  -340-м и  -185-м нуклеотидами в U3 последовательности LTR ВИЧ.

Тот же tat-3 белок активирует и трансляцию иРНК, снимая ингибирующее действие на инициацию трансляции TAR-элемента. Для полноценного синтеза структурных белков вириона необходимо действие еще одного белка - продукта гена art(trs). Этот белок появляется в результате описанных выше событий и переключает сплайсинг  на производство иРНК структурных генов. Этот же белок снимает действие негативных регуляторов трансляции, расположенных на иРНК, кодирующих структурные белки (gag и env). Предполагаемая цепь событий представлена на рисунке 3.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Конечно, предполагаемая схема содержит много “белых пятен”. Так, пока не ясно, что является исходным толчком к активации провируса. Такая активация происходит при антигенной стимуляции зараженного ВИЧ Т-лимфоцита, однако молекулярные механизмы этого явления не изучены. Важную роль в активации провируса может играть и взаимодействие вирусных генов с клеточными белками. Так, фактор транскрипции Sp1, присутствующий в клетках млекопитающих, связывается с промоторным участком в LTR промотора ВИЧ и активирует синтез РНК в 5-10 раз.

 

 

 

 

 

                       ТЕОРИИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ ВИЧ.

 

Вопрос о происхождении ВИЧ 1-го и 2-го типов является одним из ключевых в современном понимании проблемы СПИДа, поскольку его решение в значительной мере определяет направления диагностики, лечения и профилактики данной патологии.

Итак, известны следующие возбудители СПИД:

• вирус иммунодефицита человека(ВИЧ) - LAV/HTLV-3 (HIV, ВИЧ-1), распространенный в основном в Америке, Европе, центральных, восточных и южных районах Африки;
• родственные обезьяньим вирусы подгруппы западно-африканских Т-лимфотропных ретровирусов (LAV-2, HIV-2, ВИЧ-2), выделенные группой Л.Монтанье в 1986 г. От больных СПИД африканцев из Гвинеи.
• вирус HTLV-4, выделенный американскими учеными от представителей групп                    повышенного риска (Сенегал). Распространен в основном в Африке.

Описаны случаи одновременного существования в организме человека ВИЧ-1,  ВИЧ-2 и HTLV-4 в различных сочетаниях.

По поводу происхождения вирусов иммунодефицита человека в литературе представлено много данных, порою противоречивых и не всегда полных. Споры продолжаются. По мере накопления материала возникли гипотезы происхождения ВИЧ, основные из которых будут приведены ниже.

  Вирус создан искусственно в конце 70-х годов текущего столетия посредством методов генной инженерии на основе новых знаний о влиянии различного рода излучений,  иммунодепрессантов  и мононуклеарных антител на различные звенья иммунной системы.

   В естественных условиях вирус иммунодефицита человека может иметь антропогенное происхождение, а именно:

2.   ВИЧ - типичный экзогенный ретровирус, существовавший у людей с древних времен и эволюционировавший вместе с человеком при его расселении на Земле;
3.    в глухих уголках   Центральной Африки ВИЧ циркулировал и вызывал эндемические заболевания СПИД длительное время, затем через о. Гаити попал в США и в последующем довольно быстро распространялся на все континенты;
4.     ВИЧ - не  африканского происхождения, а возник и до нынешней пандемии, существовал в странах умеренного климата (Северная Америка, Европа), в силу слабой патогенности вызывая отдельные заболевания, практически не диагностируемые как СПИД

Зоонозное происхождение вируса иммунодефицита человека, что могло быть реализовано следующими путями:

6.    в начале 50-х годов нашего столетия конструирование ВИЧ произошло при генетических рекомбинациях (видимо, случайных) вируса лейкоза человека и животных (ретровируса типа С) с вирусом опухоли молочной железы мышей (ретровирус типа В) или с вирусом обезьяньего СПИД (ретровирус типа D);
7.    в древние времена мутанты вируса иммунодефицита зеленой мартышки трансформировались и обрели нового хозяина - человека;
8.    по структуре генома и биологическим свойствам ВИЧ близок к лентивирусу висна и вирусу инфекционной анемии лошадей, отмечается выраженная общность их внутренних (сердцевинных) белков.

Ряд авторов утверждают, что пробел в структуре и свойствах между вирусами иммунодефицита обезьян и человека уже частично заполнен сходными вирусами HTLV-4, ВИЧ-2, а также недавно открытым шведским ученым вирусом SBL, и процесс этот будет продолжаться.

Однако проблема СПИДа сегодня представляется настолько  нетривиальной и многоплановой, что традиционный эпидемиологический подход к указанному заболеванию как к обычной антропозоонозной инфекции вряд ли может быть исчерпывающим в трактовке генеза ВИЧ. В пояснение этому необходимо отметить, что в эволюционном аспекте ретровирусы (в первую очередь онкогенные) часто и абсолютно оправданно рассматриваются в неразрывной связи с мобильными клеточными элементами генома эукариот. Примечательным является факт удивительного структурного сходства провирусных нуклеотидных  последовательностей и перемещающихся элементов эукариотических геномов.