Использование лабораторных животных в лабораторной диагностике особо опасных вирусных инфекций

Из промытых эритроцитов готовят 3% или 5% взвесь, прибавляя к 3-5 мл эритроцитов соответственно 97-95 мл изотонического раствора хлорида натрия (для получения меньших количеств взвеси объемы обоих ингредиентов уменьшают в одинаковое число раз).

Взвесь эритроцитов можно хранить в холодильнике при температуре 3-4°С в течение 5-6 дней.

 

5.4.2 Приготовление сыворотки крови

Кровь, собранную в стерильную пробирку, закрывают ватно-марлевой пробкой, ставят на 20-30 мин в термостат или водяную баню, отрегулированную на 37°С, так как в тепле кровь свертывается быстрее и лучше. Во время свертывания сгусток крови обычно прилипает к стенкам пробирки. Поэтому после взятия пробирок из термостата сгусток отделяют от стенок пробирки круговым движением капилляра стерильной пастеровской пипетки или стеклянной стерильной палочкой.

После отделения сгустка сыворотку ставят в холодильник при температуре 3-4°С. В течение 3-4 ч сыворотка обычно отделяется полностью, и ее можно отсосать стерильной пастеровской пипеткой. Для того чтобы во время отсасывания содержимое пробирки было хорошо видно, пастеровскую пипетку соединяют со стеклянной трубкой - «мундштуком» (резиновая трубка длиной 20-25 см). При отсасывании кончик пипетки не должен соприкасаться со сгустком крови, чтобы в сыворотку не попали эритроциты.

Окрашенную в розовый цвет сыворотку центрифугируют при 2000-3000 об/мин. в течение 10-15 мин для осаждения форменных элементов крови.

При взятии крови вскоре после кормления животных, а также при повторных кровопусканиях с короткими интервалами возникает иногда липемия, т. е. появление избытка жировых веществ в крови. Сыворотки, получаемые во время липемии, бывают мутные (хилезные), иногда опалесцирующие, и это очень затрудняет чтение диагностических реакций, особенно реакции преципитации. Во избежание получения мутных сывороток кровь у животных берут натощак. Просветление липемической плазмы наступает также при введении в кровеносное русло животного гепарина, способствующего повышению концентрации в крови фермента, называемого фактором просветления. С этой целью кроликам весом 2-2,5 кг в краевую вену уха вводят за 1-1,5 ч до обескровливания 60 мг гепарина.

Форменные элементы из крови удаляют центрифугированием. В слитой с осадка плазме через короткое время после центрифугирования образуется сгусток фибрина, который уплотняется при перемешивании крови стеклянной палочкой. Затем этот сгусток удаляют. В некоторых случаях фибрин из плазмы выпадает не полностью. Для удаления остатков фибрина и выявления полноты его удаления к сыворотке прибавляют несколько капель тромбина. Освобожденную от фибрина сыворотку фильтруют через асбестовые фильтры. Полученная таким способом сыворотка совершенно прозрачна и не имеет признаков опалесценции.

 

5.4.3 Приготовление цитратной крови

Полученную из сердца или вены кровь сливают в пробирку с 5% раствором цитрата натрия (10 мл крови, 1 мл цитрата натрия). Цитратная кровь не свертывается.

 

5.4.4 Приготовление  плазмы крови

Цитратную кровь ставят на 18-20 ч в холодильник или подвергают центрифугированию. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета – плазмы.

 

6. Умерщвление  и вскрытие лабораторных животных

В лабораторной практике приняты способы умерщвления, которые характеризуются простотой приемов и вызывают быструю, безболезненную смерть животного. Мышей, крыс, морских свинок помещают в стеклянную, плотно закрывающуюся банку с кусочком ваты, пропитанным хлороформом или эфиром. Животные засыпают и гибнут в течение 3-5 минут. Кроликов умерщвляют посредством воздушной эмболии. Для этого в краевую вену уха по направлению к его основанию вводят иглу шприца. Появление капельки крови свидетельствует о том, что игла находится в вене. После этого иглу соединяют с пустым 10-граммовым шприцем, поршень которого вытянут до конца. При надавливании на поршень в кровеносную систему животного поступает находящийся в цилиндре шприца дух, вызывая эмболию и быструю смерть.

6.1 Вскрытие животных

Трупы лабораторных животных вскрывают с целью выяснения причин гибели, выделения введенного возбудителя, выявления механизма распространения микробов в организме и места их локализации, изучения патологоанатомических изменений, наступающих в результате перенесенной инфекции. Вскрытие трупов животных производят стерильными инструментами, соблюдая правила асептики.

На столе должны находиться стакан, наполненный до половины спиртом, стерильные ножницы, скальпель, анатомические и хирургические пинцеты, бактериальная петля, стерильные чашки Петри, пробирки и чашки с питательными средами, стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, стерильный изотонический раствор хлорида натрия, банка с дезинфицирующим раствором, ватные тампоны, спички и горелки (спиртовая и газовая). Вскрытие трупов следует производить таким образом, чтобы предупредить внесение микроорганизмов с поверхности в глубину тканей, а также перенос микробов из одного органа в другой. С этой целью рекомендуется вскрывать животных в агональном состоянии, усыпив их эфиром, или тотчас после наступления смерти, так как в ближайшие часы после нее проницаемость тканей нарушается, и бактерии из одного органа могут проникнуть в другой. Особую опасность в этом отношении представляет кишечник, содержимое которого изобилует микробами.

Труп животного брюшком кверху кладут на деревянную доску или лоток с пластинкой застывшего парафина, растягивают пинцетом все 4 лапы и в таком положении фиксируют их булавками или небольшими острыми гвоздиками к поверхности дерева или парафина. Грудь и брюшко протирают ватой, смоченной 5% раствором карболовой кислоты или 5% раствором хлорамина, или, лучше, смачивают спиртом и поджигают шерсть, чтобы содержащиеся на ней микробы, в том числе спороносные палочки, не разлетались и не загрязняли стерильные инструменты и органы вскрытия трупа. В процессе вскрытия придерживаются общепринятого порядка. Сначала исследуют наружные покровы и подкожную клетчатку, затем проводят вскрытие, исследование и взятие материала из органов грудной полости, а в последнюю очередь вскрытие, исследование и взятие материала из органов брюшной полости.

Обработанную кожу разрезают по средней линии живота протяженностью от симфиза до грудино-ключичного сочленения. На уровне передних и задних лап делают боковые надрезы. Кожные лоскуты отпрепаровывают от подкожной клетчатки и отворачивают в стороны, прикалывая булавками к доске.

В протоколе вскрытия отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов в паху и подмышечных впадинах. Подкожная клетчатка может быть развита сильно, слабо или умеренно. Подмышечные и паховые узлы обнаруживаются легко. При осмотре узлов обращают внимание на их величину, форму и цвет. Для бактериологического исследования лимфатические узлы раздавливают стерильным пинцетом и погружают в жидкую питательную среду или втирают в поверхность плотной питательной среды.

Сменив или простерилизовав использованные для вскрытия кожных покровов инструменты, приступают к вскрытию грудной клетки. Грудину, захваченную пинцетом, слегка приподнимают, делают под ней небольшой надрез, вводят в него браншу ножниц и перерезают ребра вначале с одной, а затем с другой стороны. Если в грудной полости есть экссудат, из него делают мазки и посев. Вновь сменив ножницы или протерев их ватой, смоченной спиртом, разрезают перикард, обнажая поверхность сердца. Накаливают на пламени горелки бранши пинцета или скальпель, прижигают поверхность сердца, затем стерильным пинцетом оттягивают кверху ушко правого предсердия и после этого через прижженное место вводят в полость желудочка или предсердия капилляр пастеровской пипетки. Кровь, поднявшуюся по капилляру пипетки, засевают в питательную среду.

Далее приступают к осмотру органов, расположенных в грудной полости, регистрируя в протоколе имеющиеся в них изменения, например наличие экссудата в полости плевры, абсцессы, гиперемию (багрово-красное окрашивание) или, наоборот, ишемию (малокровие) в легких. Кусочки легкого с выявленными в нем изменениями вырезают для бактериологического исследования.

После этого, сменив инструменты, переходят к исследованию органов брюшной полости. Передний листок брюшины вскрывают ножницами. При наличии экссудата в брюшной полости делают из него мазок и производят посев в питательную среду. Затем осматривают печень, селезенку, почки, отмечая цвет, величину органов, характеризуя их консистенцию (нормальная, дряблая, уплотненная, хрупкая) и имеющиеся очаги поражения, например абсцессы.

При локализации инфекционного процесса в желудочно-кишечном тракте делают посев содержимого желудка и кишечника, набирая его в пастеровскую пипетку через прижженную желудочную и кишечную стенки. Таким же образом для посева берут экссудат, содержимое абсцессов, желчного и мочевого пузыря.

Из паренхиматозных органов (печень, почки, селезенка) взятие материала и засев его производят одним из следующих способов.

• У стерильной пастеровской пипетки обламывают кончик и проводят ее через пламя горелки. Затем капилляром пипетки прокалывают прижженный участок исследуемого органа и насасывают в нее тканевую жидкость, которую засевают в питательную среду. Пипетки после использования опускают в банку с дезинфицирующим раствором.
• Прижженную поверхность органа надрезают стерильным скальпелем и из глубины надреза соскабливают бактериальной петлей небольшое количество материала, которое затем вносят в питательную среду.
• На прижженной поверхности органа делают надрез, остроконечными ножницами из глубины его вырезают маленький кусочек, раздавливают между браншами пинцета и опускают в жидкую питательную среду или срезом кусочка делают отпечатки на поверхности плотной питательной среды.

Изменения, обнаруженные при вскрытии трупа, а также результаты бактериологического исследования вносят в протокол вскрытия и бактериологического исследования трупного материала, составленный примерно по такому образцу:

1.       Вид лабораторного животного, взятого в опыт.

2.       Время заражения (месяц, число, час).

3.       Материал, примененный для заражения (взвесь микробов с плотной питательной среды, бульонная культура, взвесь патологического материала и т. д.).

4.       Время гибели животного (месяц, число, час).

5.       Изменения, обнаруженные при вскрытии животного в месте введения заразного материала, состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов; изменения, найденные во внутренних органах.

6.       Вид микроба, выделенного из трупного материала, его основные морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства.

После вскрытия трупы животных складывают в металлические бачки с плотно закрывающимися крышками и засыпают сухой хлорной известью. Трупы мелких лабораторных животных можно заливать раствором различных дезинфицирующих веществ: 5% раствором карболовой кислоты, 3-5% мыльно-карболовым раствором, 3-5% раствором хлорамина. Трупы животных, погибших от заражения споровыми формами микробов, заливают хлорно-известковым молоком или 5-10% осветленным раствором хлорной извести. В дезинфицирующем веществе трупы животных хранят до момента их сжигания.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лабораторные животные являются очень важными моделями для установления диагноза при инфекционных заболеваниях. Чтобы такие животные были верными помощниками врача-инфекциониста, их необходимо правильно содержать и обеспечивать полноценным кормлением с учетом минерально-витаминных добавок. Другими словами при постановке диагноза на инфекционные заболевания нужно использовать физиологически полноценных лабораторных животных.

 

 В заключение следует отметить, что в ряде случаев для подтверждения диагноза на инфекционные заболевания используют как лабораторных моделей, кроме указанных выше животных, и других. Например, при диагностике гриппа, болезни Ньюкасла кур используют здоровых особей этого вида птиц. Для подтверждения диагноза на инфекционную анемию лошадей используют для заражения молодых жеребят, для подтверждения диагноза на рожу свиней нередко используют голубей. В качестве лабораторных моделей в диагностических вирусологических лабораториях довольно часто используют 7-9-суточных эмбрионов кур и других видов птиц (уток, перепелов).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Информация с сайта http://vettorg.net/ -  Лабораторные животные - верные помощники врача при диагностике инфекционных заболеваний

2. Информация с сайта http://ru.wikipedia.org/ - Опыты на животных

3. Информация с сайта http://rudocs.exdat.com/- Основные принципы ухода за лабораторными животными и их использования

4. Информация с сайта  http://meddd.ru/ - Выделение вируса на лабораторных животных