Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Вирус инфекционного гепатита собак

МИНИСТЕРСТВО  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ   Федеральное государственное обра бюджетное  зовательное учреждение высшего пРофессионального  образования российский государственный  аграрный университет – МСха имени К.А. Тимирязева  (ФГбОУ ВПО ргау - МСХА имени К.А. Тимирязева)

 

 

 

Факультет зооинженерный

 

Кафедра  «Ветеринарии и физиологии животных»

 

 

 

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

      

по  дисциплине

 

«Ветеринарная вирусология»

 

на тему: «Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.

Вирус инфекционного  гепатита собак».

 

 

 

 

                                                                         Выполнила студентка

                                                                         32 группы очной формы обучения 

                                                                         Иванова Наталья Алексеевна

                                                                        Руководитель:

                                                                         доцент, к.б.н. Лужская Т.А.

Дата сдачи: «___»_________20__г.

Дата защиты: «___»________20__г.

Оценка:______________________                       

                                                                   

                 

 

Калуга, 2012г.

                                             ОГЛАВЛЕНИЕ

 

 

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..3

 

ГЛАВА I. Общая вирусология………………………………………………..….5

 

ЧАСТЬ 1. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах…………………..5

 

1.1. История открытия…………………………………….……...........................5

1.2. Характеристика культивирования ………………………………….………6

1.3. Способы заражения куриных эмбрионов……………….……....................7

1.4. Индикация вируса в курином эмбрионе………………………….....….....10

1.5. Недостатки метода культивирования вирусов в куриных эмбрионах…..10

 

ГЛАВА II. Частная вирусология………………..…..…………………………..11

 

ЧАСТЬ 1. Вирус инфекционного гепатита собак …………………………….11

 

1.1. Введение………………………………………………………..………...….11

1.2. Возбудитель болезни ………………………………………..………...……11

1.3. Эпизоотологические данные …………………………………….………...12

1.4. Симптомы ….………………………………………………….....…...……..13

1.5. Патогенез………………………………………………………..……...……15

1.5.1. Реакция преципитации в геле……………………………………...19

1.5.2. Иммунолюминесценция…………………………………………...20

1.5.3. Взаимоотношения с системой иммунитета………………………20

1.6. Клинические признаки……………………….……………..….……...…...21

1.7. Диагностика. …………………………………..………...……………….…24

1.8. Лечение………………………………………………………………………24

1.9. Профилактика……………………………………………………………….25

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………….27

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………….................28

 

ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………….29

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Вирусология ( от лат. virus – яд животного происхождения, logos - учение) — современная биологическая наука, занимающаяся изучением мельчайших микроорганизмов – вирусов. Как самостоятельная наука вирусология сформировалась сравнительно недавно. Несмотря на то, что заболевания вызываемые вирусами (оспа, бешенства и др.), были известны человечеству еще в глубокой древности, их изучение в основном началось только в конце 19 столетия.

Общая вирусология включает в себя:  общую характеристику и систематику вирусов; взаимодействие вирусов с чувствительными клетками; культивирование, этиологию и генетику вирусов; патогенез вирусных инфекций;  особенности противовирусного иммунитета и др..

Частная вирусология представлена в следующей последовательности: название семейства и вируса; основные свойства вируса; характеристика болезни; клиническая, эпизоотическая и лабораторная диагностика и др., то есть исследует особенности определённых групп вирусов животных и разрабатывает меры борьбы с вызываемыми этими вирусами болезнями.

Для количественного  накопления вирусов наиболее удобную  систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования  клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур. Большая заслуга в деле разработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю. Он впервые доказал возможность размножения клеток животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их “бессмертность” и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и в жидкой перемешиваемой суспензии.

Тканевые культуры давно нашли применение для решения  различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня. Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

В настоящее  время существуют следующие методы культивирования вирусов:

• на восприимчивых домашних и лабораторных животных (телята, мыши, белые крысы, кролики, морские свинки, хомяки, цыплята);
• На развивающихся куриных эмбрионах, деэмбрионированных яйцах и эмбрионах других видов птиц;
• В культуре ткани и клеток.

В первой части подробно будет описан один из методов культивирования вирусов, а именно культивирование на куриных эмбрионах.

Во второй части подробно будет описана одна из болезней - заболевание вирусом инфекционной болезни гепатита собак, имеющее большое значения для предупреждения заболевания и осуществление общих ветеринарно-санитарные мероприятия: предупреждение заноса возбудителя; своевременное диагностирование гепатита; проведение мероприятий, направленных на ликвидацию болезни.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА I. Общая вирусология

ЧАСТЬ 1. Культивирование вирусов в куриных  эмбрионах

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением  особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

1. История открытия

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах  – наиболее совершенный метод. Впервые  он был применен Раусом в 1911 году для выделения вируса саркомы белых мышей. Однако идея использования куриных эмбрионов для выращивания вирусов не была оставлена и вскоре получила реальное воплощение. Ведь использовать целый эмбрион гораздо удобнее, чем только часть его. Куриный эмбрион - это автономный, снабженный всем необходимым организм, защищенный яичной скорлупой, от природы наделенный всеми необходимыми защитными средствами от бактерий. Они дешевы и доступны, и их можно получать в необходимых количествах. И в 1931 году Вудраффом и Гудпасчером были проделаны опыты – они заразили хорионов-аллантоисную оболочку куриного эмбриона вирусом оспы птиц, и с этого времени культивирование вирусов стало такой же легкой процедурой, как и выращивание бактерий.

Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, оспа птиц, ларинготрахеит и др.), успешно развиваются на хорион-аллантоисной оболочке, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители микровирусов (грипп А, В и С, Ньюкаслская болезнь, классическая чума птиц, эпидемический паротит, инфекционный бронхит птиц, вирусный гепатит утят, арбовирусы и др.) хорошо репродуцируются в курином эмбрионе при введении их в аллантоисную полость. Некоторые крупные вирусы культивируются в желточном мешке эмбриона, вакцинные штаммы вируса чумы КРС репродуцируются в эмбрионе при внутривенном его заражении.

В 1937 году выращивание  вирусов в оплодотворенных куриных  яйцах позволило практической медицине одержать крупную победу. Бактериологи Рокфеллеровского института постоянно вели поиски средств, способных оказать помощь в борьбе против вируса желтой лихорадки. Ведь уничтожить комаров полностью было невозможно, помимо этого постоянными носителями инфекции в тропиках были обезьяны. Южноафриканский микробиолог Макс Тейлер, работавший в Рокфеллеровском институте, поставил перед собой цель получить ослабленную культуру вируса желтой лихорадки. Он пассировал вирус, перепрививая его от одного животного к другому, от одного эмбриона к другому, для чего использовал 200 мышей и 100 куриных эмбрионов, пока не получил мутант, который вызывал лишь легкие симптомы желтой лихорадки, но зато способствовал развитию полной невосприимчивости к этой болезни. За эту работу Тейлер в 1951 году был удостоен звания лауреата Нобелевской премии в области медицины и физиологии.

2. Характеристика культивирования

Культивирование в куриных эмбрионах – наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения многих вирусов животных, так и для последующего культивирования их в лаборатории.

В основе метода лежит удаление эмбриона (деэмбринирование) до яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорион-аллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образуется своеобразная культура ткани, в которой может репродуцироваться вирус.

Метод обладает рядом преимуществ, так как позволяет  получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала, а отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител способствует размножению некоторых видов вирусов.

Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых  инкубаторах или термостатах  при 37-37,5^оС,относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4-13 дневные эмбрионы с зараженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или исследуемую культуру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или в амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже культуру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, которые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрываю. Для этого после обработке спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорион-аллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта. На размножение вирусов в них существенное влияние оказывает температура инкубации, возраст эмбрионов, метод заражения и количество введенного вируса. Многое вирусы (чума птиц, гриппа, герпеса и др.) активно репродуцируются при температуре от 32 до 37^оС. Некоторые специально селекционированные штаммы удовлетворяет более низкая температура (23…28^оС), но скорость репродукции при этом значительно ниже. При температуре 39…40^оС вирусы размножаются быстрее, а при 41…42^оС, как правило, они не размножаются. Наиболее активно накапливается вирус при введении в эмбрион 1000…10000 инфекцированных доз.

3. Способы заражения куриных эмбрионов

Для заражения  выбирают здоровые эмбрионы. Для этого  проводят овоскопию. На скорлупе делают пометки карандашом - границы воздушной камеры и местоположение зародыша.

Существует  несколько способов заражения:

1. Заражение в аллантоисную полость.

10-суточные эмбрионы  зара-жают через отверстия, сделанные  в скорлупе и подлежащих оболочках  (см. выше). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут:

• название вируса

• дату

• фамилию

2. Заражение через искусственную  воздушную камеру на ХАО.

1. Делается отверстие в области воздушной камеры.

2. Делается окошко «А»
3. Отсасывается воздух из воздушной камеры.
4. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем.
5. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия.

 

3. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку;

 

Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы.

Применяется для  выделения и культивирования  вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорион-аллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорион-аллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают Вирусный материал (0,05 – 0,2 мл) наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают  расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).