Культуральные и тинкториальные свойства бактерий

 

 

4.Тинкториальные свойства бактерий.

 

     Бактериальные клетки являются полупрозрачными, слабо преломляют свет, оттого при обычных методах микроскопии в неокрашенном состоянии их тяжело выявить. Для выявления бактерий в нативных препаратах используют микроскопию в темном поле зрения, фазово-контрастную и аноптральную микроскопию, а также микроскопию в обычном световом микроскопе с опущенным конденсором. Однако эти методы исследования недостаточно информативные и имеют ограниченное применение при микробиологической диагностике. Намного больше значение имеет микроскопическое изучение предварительно убитых, а затем окрашенных бактерий. В микробиологии более часто применяют для окраски микроскопических препаратов анилиновые красители. При простой окраске используют один краситель, сложные методы окраски проводятся с применением ряда красителей и других веществ в несколько этапов. Простая окраска является удобной для обзорной микроскопии, выявления формы и взаиморасположения бактерий. Сложные методы окраски позволяют выявить тонкие детали строения бактерий и провести цитохимическое исследование для выявления химических компонентов бактериальной клетки.

     Разработка и использование методов окраски позволили подробно изучить морфологию бактерий, выявить структурные элементы, которые имеют дифференциальное значение и важные для идентификации бактерий, изучить отличия между бактериями в способности воспринимать красители, которая определяет так называемые тинкториальные свойства бактерий.

 

     Тинкториальные свойства бактерий (лат. tinctura, от tingo - окрашиваю) способность к окраске: восприимчивость к окраске, кислото-спирто-щелочеустойчивость, равномерность окраски, метахроматичность, отношение к окраске по методу Грама.

 

Восприимчивость к окраске у большинства видов бактерий является высокой, они легко и быстро воспринимают окраску. Как правило, перед окраской бактерии фиксируют в пламени или химическими фиксаторами, в результате чего бактерии погибают и лучше воспринимают красители. При окраске в живом состоянии ферментные системы бактерий могут разрушать и обесцвечивать краситель, оттого прижизненное (витальное) окрашивание редко применяется в микробиологии.

 

     Отдельные структурные элементы бактериальной клетки по-разному воспринимают красители. Споры и капсулы, которые имеют дифференциальное значение плохо воспринимают красители и не окрашиваются при обычных методах окраски. Но, их можно заметить в обычных окрашенных препаратах: спора видна как светлое тельце на фоне окрашенной цитоплазмы или ее остатков, капсула в виде светлого ореола на окрашенном фоне препарата вокруг интенсивно окрашенного тела бактерий. Разработаны и используются в диагностической практике специальные сложные методы окраски спор и капсул, с которыми студенты знакомятся на практических занятиях.

 

     Не воспринимают окраски в обычных условиях некоторые бактерии, которые являются кислото-спирто-щелочеустойчивыми, то есть не погибают при действии растворенных кислот, щелочей и спирта. К ним относятся микобактерии туберкулеза, проказы, некоторых актиномицеты. Кислотоустойчивость этих бактерий обусловлена высоким содержанием липидов, наличием миколовых кислот и физико-химическими особенностями их клеточной стенки. У микобактерий до 40 % сухого остатка составляют липиды. Выявленные три фракции липидов:

фосфатидная (растворимая в эфире);

жировая (растворимая в эфире и ацетоне);

 восковая (растворимая в эфире и хлороформе).

      В составе липидов есть различные кислотоустойчивые жирные кислоты: миколовая, туберкулостеариновая, фтионовая и др. Липиды и миколовые кислоты определяют гидрофобность клеточной поверхности, которая добавляет клетке стойкость к действию растворенных в воде токсических веществ. Ненасыщенные кислоты, которые составляют 50 % от всего количества миколовых кислот, остаются жидкими даже при низких температурах и обеспечивают эластичность оболочки, необходимую для транспорта гидрофобного субстрата. Поэтому некоторые свободноживущие сапрофитные микобактерии способны использовать гидрофобные субстраты, в частности парафины нефти. Существует зависимость между количественным содержанием миколовых кислот и степенью кислотоустойчивости. Кислотоустойчивость сохраняется только при целостности клеточной стены, появление даже небольшого дефекта стенки приводит к потере кислотоустойчивости.

     Кислотоустойчивость является дифференциально-диагностическим признаком и используется для выявления и идентификации бактерий. Кислотоустойчивость бактерии окрашивают интенсивным методом – концентрированным раствором карболового фуксина при подогревании. Восприняв красную окраску, кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются при обработке кислотой, щелочью или спиртом. Поэтому после окраски фуксином препарат дифференцируют 5 - 10 % серной кислотой или подкисленным спиртом и после промывания водой дополнительно окрашивают обесцвеченные кислоточувствительные микроорганизмы контрастным красителем, например метиленовым синим.

 

Равномерность окраски. Большинство патогенных бактерий окрашивается равномерно, причем детали внутренней структуры бактериальной клетки не оказываются. Часто видимая гомогенность окраски обусловлена тем, что краситель интенсивно связывается с оболочками клетки и маскирует окраску внутренних структур. Например, только при использовании очень разбавленных растворов кристаллвиолета удается получить избирательное окрашивание гранул волютина, в то время, как краситель в обычной концентрации дает равномерную окраску клетки. Однако, некоторые бактерии (палочки чумы) и при обычных методах окраски могут окрашиваться биполярно, в виде «английской булавки», то есть более интенсивно по полюсам, а центр остается слабоокрашенным. Неравномерно окрашиваются также спороносные палочки, поскольку спора не прокрашивается.

 

Метахроматичность (греч. meta - изменение, chroma - цвет) способность окрашиваться в другой цвет, чем цвет основного красителя. Диагностическое значение имеет метахроматичность зерен волютина у коринебактерий дифтерии. При окраске метиленовым синим, толуидиновым синим гранулы волютина окрашиваются в фиолетово-красный, вишневый цвет. Обычно для выявления зерен волютина окраски проводят щелочным метиленовым синим, при этом волютин окрашивается в темно-синий, а тело клетки - в голубой цвет.

 

Отношение к окраске по Граму. В 1884 г. Х. Грам предложил метод окраски для выявления некоторых бактерий в тканях животных. В дальнейшем этот метод окраски распространился в микробиологии, и на отношении к окраске за Граммом основанное разделение подавляющего большинства бактерий на грациликуты (грамотрицательные) и фирмикуты (грамположительные).

     Окраска по Граму заключается в том, что сначала препарат окрашивают генцианвиолетом (кристалвиолетом, метилвиолетом и др.), потом обрабатывают водным раствором йода (в виде раствора Люголя) и дифференцируют этиловым спиртом. Одни бактерии, грамположительные, сохраняют при этом темно-фиолетовую окраску, другие, грамотрицательные, обесцвечиваются спиртом и затем окрашиваются раствором фуксину в контрастный красный цвет.

 

 

     Клеточная  стена грамположительных бактерий характеризуется высоким содержанием пептидогликана (муреина), который образует толстый многослойный мешок, наличием частых поперечных пептидных связей между нитями гликана, присутствием в муреиновом слое тейхоевых кислот, малым содержанием липидов. В результате обработки спиртом происходит разбухание муреинового слоя и уменьшение диаметра пор клеточной стенки, которая приводит к снижению ее проницаемости. Поэтому комплексное соединение генцианвиолета с веществом цитоплазмы и йодом у грамположительных бактерий хоть и растворяется в спирте, но не может выйти через клеточную стенку, и клетка сохраняет первичную окраску.

     Клеточная  стена грамотрицательных бактерий имеет тонкий крупноячеистый слой муреина с редкими поперечными связями и содержит много липидов, которые растворяются и вымываются при обработке спиртом. Поэтому проницаемость клеточной стены, и так более высокая, чем у грамположительных бактерий, увеличивается еще больше, и краситель легко вымывается спиртом, наступает обесцвечение грамотрицательных бактерий.

     Доказательством того, что в окраске по Граму основную роль играет клеточная стенка, является тот факт, что при нарушении целостности клеточной стены после обработки лизоцимом, под действием пенициллина или в результате дегенерации бактерий при старении культуры грамположительных бактерии окрашиваются грамотрицательно.

 

5. Выделение чистых культур  микроорганизмов.

 

     Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий -обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной практике, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и в целом при любой работе с микроорганизмами.

     Исследуемый материал (вода, почва, воздух, пищевые продукты или другие объекты) обычно содержит ассоциации микробов. Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, т. е. производится его идентификация.

     Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп:

 

1. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

 

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и в дальнейшем при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

 

3. Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу, на месте посева. Пересевая верхние края культуры, можно получить чистую культуру.

 

4. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках.

     С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 суток выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

 

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 оС агаризированной питательной среде.

     Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды.

     Для извлечения изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

 

6. Метод Хангейта. Когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку; среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

 

7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.