Определение интенсивности дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки

Министерство сельского  хозяйства РФ

Департамент научно-технологической  политики образования

ФГОУ ВПО Иркутская  государственная сельскохозяйственная академия

Факультет биотехнологии  и ветеринарной медицины

 

Кафедра анатомии, физиологии, патофизиологии, акушерства, гинекологии и биотехники размножения животных.

 

 

Контрольная работа

По предмету «Биотехника  размножения»

 

 

 

Выполнила: студентка 5 курса  заочного обучения факультета БиВМ

Шифр: 10321

Бойко Мария Александровна

      Проверила: Балтухаева Т. А.

 

Иркутск 2013

 

 

 

 

Определение интенсивности  дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки.

Этот метод основан  на использовании спермиями кислорода  синьки, добавленной в сперму. Для определения интенсивности дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки необходимы следующие материалы и оборудование: свежеполученная сперма, раствор метиленовой синьки в концентрации 0,01% , стеклянная трубочка с каналом диаметром 0,8-1 мм и длиной 6-8 см, глазные пипетки, песочные часы, предметные стекла, лист белой бумаги.

Вначале готовят 0,01% -ный раствор метиленовой синьки. Для этого отвешивают 100 мг метиленовой синьки и растворяют ее в 100 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия. Полученный раствор настаивают три дня. Затем к 10 мл раствора добавляют 90 мл 0,9% -ного раствора хлористого натрия и тщательно размешивают.

На чистое предметное стекло глазной пипеткой наносят одну каплю  свежеполученной спермы быка или барана и к ней добавляют каплю раствора метиленовой синьки. Обе капли быстро перемешивают стеклянной трубочкой, и смесь набирают в ее канал, чтобы столбик в нем был длиной около 2 см. На лист белой бумаги кладут трубку окрашенной спермы и определяют по секундомеру время, в течение которого наступит обесцвечивание голубого столбика. На концах столбика остаются голубые кольца (сперма соприкасается с воздухом).

Исследования проводят при температуре 20-22°С. Полученные результаты сверяют с таблицей, по которой определяют качество спермы.

Оценка качества спермы по времени обесцвечивания метиленовой синьки
Качество спермы	Время обесцвечивания спермы метиленовой синьки в сперме, в мин
		быка	барана
Хорошее	5-10	3-7
Среднее	11-30	8-12
Плохое (непригодное для осеменения)	Более 30	Более 12

 

 

Определение концентрации спермиев в счетной камере.

Для определения концентрации спермиев в счетной камере необходимы следующие материалы и оборудование: счетная камера Горяева, смесители (меланжеры) эритроцитные и лейкоцитарные, покровные стекла Шлифованные, дистиллированная вода, спирт 96%-ный, эфир, 3%-ный раствор хлористого натрия, резиновая груша или шары Ричардсона, марлевые салфетки, спиртовые тампоны, вата, счетчик для форменных элементов крови.

Для подсчета концентрации спермиев используют в основном счетную камеру с сеткой Горяева. Она состоит из толстого предметного стекла, на котором имеются три площадки, разделенные поперечными прорезями. Средняя площадка разделена прорезью еще на две и опущена на 1/10 мм ниже, чем боковые. На каждой из средних площадок нанесены две квадратные сетки площадью по 9 мм². Каждая сетка имеет по 225 больших квадратов, из которых 25 разделены продольными и поперечными линиями на 16 маленьких квадратиков. Каждая сторона малого квадрата равна 1/20 мм, а площадь — 1/400 мм². Если накрыть среднюю пластину шлифованным покровным стеклом и притереть его к боковым пластинам (до появления радужных колец), то под ним глубина камеры будет равна 1/10 мл, а объем над поверхностью маленького квадратика составит 1/400 мм³. Для подсчета спермиев сперму предварительно разбавляют 3% -ным раствором хлорида натрия. Под влиянием гипертонического раствора хлорида натрия спермин становятся неподвижными, что облегчает технику подсчета. Для разбавления спермы используют эритроцитные или лейкоцитные смесители (меланжеры). Смеситель состоит из капилляра с шарообразным расширением, внутри которого имеется бусинка, служащая для лучшего смешивания спермы с раствором.

На эритроцитарном смесителе (с красной бусинкой-меланнере) нанесены деления: 0,5; 1,101. Таким смесителем пользуются для разбавления густой спермы быка и барана в 100 и 200 раз. На лейкоцитарном смесителе (с белой бусинкой) имеются деления: 0,5; 1; 11. Им пользуются для разбавления спермы хряка и жеребца в 10 и 20 раз. Для подсчета спермиев чистую счетную камеру и шлифованное покровное стекло протирают спиртовым тампоном или промывают эфиром, а затем сухой марлевой салфеткой. Смесители промывают дистиллированной водой, 96% -ным спиртом и эфиром и просушивают продуванием воздуха резиновой грушей или шаром Ричардсона.

В эритроцитарный смеситель набирают сперму быка до деления 1 и сперму барана до деления 0,5. Сперму хряка и жеребца набирают в лейкоцитарный смеситель до деления 0,5. После этого в смеситель набирают 3%-ный раствор хлорида натрия до деления 101 (в эритроцитарный) или до деления 11 (в лейкоцитарный). Зажимают оба конца смесителя большим и указательным пальцами и встряхивают в течение 2-3 мин. Перемешав сперму с раствором, удаляют из смесителя четыре капли жидкости. Этим достигается удаление из капилляра смесителя раствора, не смешанного со спермой. Конец капилляра смесителя обтирают салфеткой или ватой. Хорошо притирают покровное стекло к пластинкам камеры и наносят сбоку на сетку небольшую каплю разбавленной спермы. Подсчет спермиев производят при увеличении микроскопа в 200-400 раз в пяти больших квадратах (80 малых) по диагонали. Считают только головки спермиев, расположенные внутри малых квадратов и лежащие на их левых и верхних линиях. Количество считанных спермиев в каждом большом квадрате записывают. Концентрацию спермиев вычисляют по формуле:

 

 

где С — концентрация и П — количество подсчитанных спермиев; Д — степень разбавления; N — число сосчитанных малых квадра¬тов (80); Р — глубина камеры, мм.

Множитель 400 введен в формулу для пересчета на 1 мм², так как площадь малого квадрата равна 1/400 мм². Вычисленная концентрация спермиев разделена на 1 000 000, поэтому полученное содержание спермиев будет выражено в миллионах на 1 микрометр (мм³) или в миллиардах в 1 мл (см³). Для быстрого подсчета спермиев пользуются клавишным счетчиком для форменных элементов крови. При подсчете спермиев в первом большом квадрате нажимают пальцем на первую клавишу счетчика столько раз, сколько в квадрате есть спермиев. При подсчете во втором квадрате нажимают на вторую клавишу и так до пятого. Над каждой клавишей вверху цифра укажет сумму подсчитанных спермиев. После подсчета суммируют число спермиев в пяти больших квадратах. Полученное число спермиев в 80 малых квадратах в сперме быка делят на 200, в сперме барана — на 100, в сперме хряка и жеребца — на 1000. Получают число спермиев (в млрд) в 1 мл спермы. Если число спермиев быка в пяти больших квадратах 240, то концентрация спермиев составляет 240 : 200 =1,2 млрд в 1 мл спермы.

Счетные камеры и шлифованные стекла после работы тщательно моют вначале простой, а потом дистиллированной водой и насухо вытирают марлевой салфеткой. Из смесителей удаляют остатки спермы, немедленно промывают их дистиллированной водой, 96%-ным спиртом и эфиром, а затем просушивают воздухом при помощи спринцовки или шаров Ричардсона.

Определение концентрации спермиев при помощи фотоэлектрокалориметра.

Определение концентрации спермиев с использованием этих приборов состоит в том, что при пропускании через кювету со спермой пучка света определенной силы он, попадая на селеновый фотоэлемент, отклоняет стрелку гальванометра. Отклонение ее зависит от величины электрического тока, проходящего через гальванометр, которая обратно пропорциональна мутности спермы.

Для определения концентрации спермиев при помощи фото-электрокалориметра (ФЭК-М) необходимы следующие материалы и оборудование: 3,5%-ный раствор лимоннокислого натрия трех-замещенного пятиводного (тщательно профильтровать через бумажный фильтр для удаления механических примесей); микропипетка вместимостью 0,1 мл; микропипетка вместимостью 0,2 мл; пипетка градуированная вместимостью 10 мл; чистые сухие флаконы с пробками из-под пенициллина или других антибиотиков, можно использовать вместо флаконов пробирки на 15-20 мл по числу предполагаемых к исследованию эякулятов; марлевые салфетки для протирки кювет и микропипеток — 3-4; фильтровальная бумага (нарезать квадратиками 5x5 см); смесь спирта с эфиром (в равных частях) — 20 мл; промывалка на 0,5 л, наполненный дистиллированной водой для промывания кювет после каждого исследования; чашка толстостенная 0,5 л; деревянные палочки с острым концом (длина 8 см, диаметр 4 мл — 2-3 шт.); фотоэлектрокалориметр ФЭК-М.

Прежде чем приступить к работе, стрелку гальванометра необходимо освободить от фиксации, для чего снять с клемм соединительную металлическую нить и подключить гальванометр к клеммам фотоэлектрического калориметра, которые находятся внизу с левой стороны. При этом рукоятку включения гальванометра обязательно поставить в положение «выкл.», т. е. на 0 (ноль).

Стабилизатор соединительной колодкой подключают через специальное гнездо к ФЭК-М (справа внизу), а соединительной вилкой в электросеть. При переводе тумблера стабилизатора в положение «вкл.» зажигается осветительная лампа электрического фотокалориметра и появляются два параллельных пучка света, если открыта шторка.

Необходимо проверить, правильно  ли установлена осветительная лампа. Для этого следует прикрыть папиросной бумагой окна световых пучков в верхней части гнезд кюветодержателей. Если изображение нити лампы довольно четкое и располагается посередине как в правом, так и в левом окне, осветительная лампа установлена правильно. Если же изображение расплывчатое, нечеткое и сдвинуто с центра, установка осветительной лампы неправильная. В этом случае показания прибора будут неточные. Правильная установка лампы осуществляется регулировочными винтами, расположенными в передней части прибора.

Определять концентрацию спермиев на ФЭК-М начинают спустя 15-20 мин после включения лампы и засветки фотоэлементов. Для повышения точности исследований рукояткой устанавливают красные светофильтры. Левый отсчетный барабан с помощью рукоятки также выставляют на 0 (ноль) по красной шкале (шкала оптической плотности). Затем во флакон наливают 10 мл 3,5% -ного раствора лимоннокислого натрия и вносят туда микропипеткой 0,1 мл спермы быка или берут 5 мл этого раствора и 0,05 мл спермы быка. Как в том, так и в другом случае сперма разбавляется в соотношении 1:100.

Сперму барана разбавляют в соотношении 1:400, т. е. берут 10 мл 3,5% -ного раствора лимоннокислого натрия и 0,025 мл спермы.

Сперму хряка разбавляют в соотношении 1:30, т. е. к 12 мл 3,5%-ного раствора лимоннокислого натрия добавляют 0,4 мл спермы, которая перед взятием пробы должна быть профильтрована через два слоя плотной капроновой ткани для отделения студенистого секрета.

При взятии проб спермы нужно  стремиться к высокой точности. Пробы необходимо отбирать только микропипетками вместимостью 0,1-0,5 мл из середины свежеполученных эякулятов, не допуская попадания в микропипетку пены или вазелина. Перед внесением пробы спермы в раствор микропипетки следует вытирать снаружи чистой марлевой салфеткой для удаления излишней спермы. После внесения спермы в раствор микропипетку надо 2-3 раза прополаскать в этом же растворе. Температура 3,5% -ного раствора лимоннокислого натрия должна быть в пределах 18-25°С.

Для экономии времени указанное  для каждого вида животных количество 3,5%-ного раствора лимоннокислого натрия для разбавления проб спермы желательно разлить заранее в чистые сухие флакончики (пробирки) и закрыть пробками. Количество флаконов с раствором должно соответствовать количеству предполагаемых для исследования эякулятов.

После разбавления сперму тщательно перемешивают, осторожно переворачивая закрытый флакон в руке, наливают в кювету с рабочей длиной 10 мм до метки и быстро определяют ее оптическую плотность. Для этого на пути прохождения пучка света ставят в левый кюветодержатель чистую кювету рабочей длиной 10 мм, наполненную 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия, а в правый кюветодержатель — две такие же кюветы: одну с разбавленной спермой, другую — с 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия. Заполнять кюветы надо до метки. При этом кювету с разбавленной спермой устанавливают на пути прохождения пучка света (как в левом кюветодержателе), а кювету с раствором — в запасное гнездо этого же кюветодержателя. Кюветы как в правом, так и в левом кюветодержателе надо всегда устанавливать перпендикулярно к пучку света в одно и то же положение — лучше вверх до упора, то есть на расстояние, наиболее удаленное от фотоэлементов. Несоблюдение этого условия приводит к значительным ошибкам.

После установки закрывают  крышку прибора и включают гальванометр рукояткой сначала на грубую чувствительность в положение «I». Затем в правом кюветодержателе меняют местами кюветы так, чтобы на пути прохождения света стала кювета с 3,5% -ным раствором лимоннокислого натрия. Это достигается путем незначительного поднятия всего кюветодержателя и поворота его вокруг оси.

Опустив крышку прибора (при исследовании она всегда должна быть закрыта), опять включают гальванометр сначала на грубую чувствительность и, уже не трогая рукоятку нейтральных клиньев, рукояткой отсчетного барабана 2 (вращая ее по часовой стрелке) подводят отклонившуюся стрелку гальванометра к 0 (ноль). Включают гальванометр на высокую чувствительность и, вращая рукоятки этих же счетных барабанов (они между собой неподвижно спарены), точно устанавливают стрелку гальванометра на О (ноль), после чего сразу же включают гальванометр (рукоятку переводят в положение 0 (ноль)). Отсчет берут по красной шкале левого барабана и смотрят, какой величине концентрации он соответствует на калибровочной кривой (или таблице), которую выводят заранее.

Построение калибровочной  кривой. Для определения концентрации спермиев на ФЭК-М необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображащую зависимость оптической плотности от концентрации спермиев.

Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбирают несколько таких, в которых концентрация спермиев наиболее высокая. Тщательно определяют концентрацию спермиев в счетной камере.