Определение интенсивности дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки

Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,5% -ным раствором лимоннокислого натрия 1:1, 1:2, 1:3 и т. д. готовят ряд образцов спермы и уточняют концентрацию спермиев в каждом из них в счетной камере.

Определяют величину оптической плотности каждого образца на приборе, как описано выше. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строят для спермы каждого вида животных свою калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси — известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной — соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки. Калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а количество точек, лежащих выше и ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым.

Кривая не должна быть сильно изогнутой или изломанной, а более или менее приближаться к прямой линии.

Имея калибровочную кривую, можно легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно лишь установить его оптическую плотность на приборе и посмотреть, какой величине концентрации она соответствует на калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена и калибровочная кривая. Надо применять ту же кратность разбавления спермы, использовать кюветы той же рабочей длины, те же светофильтры и тот же способ отсчета величины оптической плотности.

Калибровочную кривую следует  ежемесячно проверять, так как показания  прибора могут изменяться (стареют фотоэлементы, лампы накаливания и гальванометр).

Для удобства определения  концентрации спермиев можно пользоваться таблицами и коэффициентами-множителями, которые легко вывести из калибровочной кривой. Чтобы получить коэффициент-множитель, нужно среднеарифметическую концентрацию 15-20 образцов спермы разделить на соответствующую ей среднеарифметическую величину оптической плотности.

При помощи коэффициента-множителя и величины оптической плотности эякулята можно очень легко определить концентрацию спермиев, умножить первую величину на вторую. Обычно коэффициент-множитель при соблюдении указанных выше условий на ФЭК-М для спермы быка очень близок к 2, хотя для каждого прибора он может несколько варьироваться, поэтому калибровочную кривую необходимо выводить отдельно для каждого прибора.

 

Точность электрофотометрического  метода определения концентрации спермиев и источник ошибок.

По точности электрофотометрический метод определения концентрации спермиев почти не уступает методу определения в счетных камерах. Величина ошибки колеблется в пределах ±6%.

Это обусловлено в основном влиянием плазмы спермы и неточностью взятия проб. Влияние пигментации плазмы на точность результатов исследования резко ослабляется при применении красных монохроматических светофильтров. Электрофотометрический метод определения концентрации спермиев довольно прост по методике выполнения, но из-за высокой чувствительности требует исключительной аккуратности в работе.

Основными источниками ошибок могут быть:

1) грязные кюветы, флаконы, пробирки, микропипетки и пр., т. е. все те предметы, которые имеют контакт со спермой во время подготовки ее к исследованию;

2) неточность взятия проб спермы микропипетками;

3) неточность в разбавлении спермы перед исследованием;

4) всевозможные механические примеси в 3,5% -ном растворе лимоннокислого натрия (непрофильтрованный раствор);

5) загрязнение оптики прибора в результате неаккуратной работы с ним;

6) несвоевременность исследования проб спермы, что может привести к их подсыханию или биологическому загрязнению (развитию микрофлоры).

Для получения точных результатов не следует допускать перечисленных недостатков в исследовании. Кювету со спермой после каждого исследования необходимо прополаскивать дистиллированной водой не менее 3 раз. Остатки воды в кювете убирают промокательной бумагой, а для исследования очередного образца спермы берут другую кювету такой же длины (в наборе к приборам их несколько).

Кюветы берут только за боковые грани, чтобы не загрязнять рабочие плоскости.

После окончания работы все кюветы тщательно моют дистиллированной водой. Несмываемые водой загрязнения устраняют смесью спирта с эфиром. Для этого используют марлевый тампон, намотанный на деревянную палочку. Применять стеклянные или металлические предметы для протирки кювет категорически запрещается, так как ими легко нанести царапины. При выходе из строя кювет с рабочей длиной 10 мм можно пользоваться при работе с фотоэлектрическим колориметром ФЭК-М кюветами другой рабочей длины (5 или 20 мм), но при этом кратность разбавления спермы надо изменить прямо пропорционально рабочей длине выбранной кюветы. Так, если пользоваться кюветами с рабочей длиной 5 мм, которая в 2 раза меньше рекомендуемой, полученную концентрацию спермы следует увеличивать в 2 раза.

При использовании кювет  с рабочей длиной 20 мм полученную концентрацию спермы следует уменьшить  вдвое.

Определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического  стандарта.

При отсутствии фотоэлектрокалориметра допускается определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического стандарта. Для этого необходимы следующие материалы и приборы: стандарт; пробирка такого же диаметра, как и стандарт; 1% -ный раствор хлористого натрия; микропипетка вместимостью 0,1 мл; марлевые салфетки; газетный лист; свежеполученная сперма хряка. При этом в пустую пробирку такого же диаметра, как и стандарт, наливают 1 мл чистого 1% -ного раствора хлористого натрия. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спермы. Край микропипетки, который погружался в сперму, вытирают снаружи марлей и вносят сперму в пробирку с физиологическим раствором. Микропипетку обязательно промывают в этом же физиологическом растворе 1-2 раза. Пробирку слегка встряхивают, держат ее рядом со стандартом, который предварительно должен быть хорошо взболтан, а сзади вплотную прикладывают газетный лист или книжный текст. Пробирку со спермой и оптический стандарт мутности вплотную прикладывают к листу с текстом держат на уровне глаз падающего света. Пробирку со спермой сравнивают с различными стандартами мутности к цвету пробирке со спермой. Определяют концентрацию спермин в миллионнах в 1 мл спермы, согласно цифре, указанной в стандарте.

К исследуемой сперме добавляют  пипеткой физиологический раствор  в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом (для более точной оценки желательно сравнение оптической плотности проводить на разных шрифтах). Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.

После того как оптическая плотность исследуемой спермы и  стандарта уравняются, проводят расчет по следующей формуле:

К=50(п + 0,1),

где К — концентрация спермы, млн/мл; п — объем добавленного 1% -ного раствора хлористого натрия, мл; 50 — коэффициент.

Стандарт соответствует  оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн/мл.

П р и мер. Для выравнивания оптической плотности до стандарта к исследуемой сперме добавлено всего 4,5 мл 1%-ного раствора хлористого натрия (с учетом раствора, ранее налитого в пустую пробирку). К = 50(4,5 + 0,1) = 50 х 4,6 = 230 млн/мл. Следовательно, в 1 мл исследуемой спермы содержится 230 млн спермиев.

Определение концентрации спермиев жеребца по стандартам.

Стандарты представляют собой стеклянные запаянные пробирки одинакового диаметра с жидкостью, имитирующей сперму жеребца разной концентрации: 10-50-100-200-300-500 млн спермиев в 1 мл.

Сперму наливают в прилагаемую  пустую пробирку такого же диаметра и сравнивают со стандартом. Предварительно стандарты встряхивают, чтобы равномерно размешался осадок. Пробирки просматривают на свет, при этом подбирают стандарт, наиболее близкий по густоте к определяемой сперме, который и принимают за ее концентрацию.

Концентрация спермиев может быть определена и как промежуточная между двумя стандартами, например 75 млн (между 50 и 100 млн) и т. д. Для большей точности определения к сравниваемым пробиркам сзади вплотную прикладывают стеклянную палочку.

При концентрации более 500 млн спермиев в 1 мл спермы ее можно разбавить 7%-ным раствором глюкозы в 2 раза (1:1), затем установить концентрацию по стандартам и сделать пересчет на неразбавленную сперму.

 Определение  абсолютной выживаемости спермиев.

Для более полной характеристики качества спермы определяют абсолютный показатель выживаемости спермиев — продолжительность их жизни при различных степенях разбавления спермы синтетической средой. Для этого неразбавленную сперму и сперму при различных степенях разбавления хранят при температуре около 0°С и ежедневно определяют активность спермиев до тех пор, пока не установят полную гибель во всех пробах.

При определении абсолютной выживаемости спермиев необходимы следующие материалы и оборудование: сперма; микроскоп; термостат или обогревательный столик; пробирки емкостью по 2 мл; измерительные пипетки на 1-2 мл; специальный штатив; термос со льдом; стеклянные палочки или глазные пипетки; синтетическая среда; 2,9%-ный раствор лимоннокислого натрия.

Для определения абсолютного  показателя выживаемости спермиев 11 стерильных пробирок по 2 мл нумеруют восковым карандашом или тушью. Во все пробирки, за исключением первой, наливают пипеткой по 0,5 мл синтетической среды. В первую (пустую) и вторую пробирки наливают по 0,5 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка служит контролем. Сперму во второй пробирке смешивают со средой и из нее переносят 0,5 мл в третью пробирку; в третьей пробирке смесь размешивают и переносят 0,5 мл в четвертую пробирку и т. д. Из последней пробирки 0,5 мл раствора выливают. Таким образом, в первой (контрольной) пробирке сперма неразбавленная, а в пробирках со второй по одиннадцатую сперма разбавлена в 2, 4, 8,16, 32, 64, 128, 256, 512 и 1024 раза. Затем оценивают активность спермиев из каждой пробирки. Пробирки со спермой устанавливают в штатив, закрывают стерильными пробками и ставят на хранение при температуре около 0°С в термос. В последующем ежедневно оценивают активность спермиев под микроскопом при температуре 40°С. Перед исследованием к капле спермы на предметном стекле добавляют две капли 2,9% -ного раствора лимоннокислого натрия, накрывают покровным стеклом и кладут на предметный столик микроскопа. Оценку активности проводят до установления гибели всех спермиев во всех пробирках. Результаты исследований заносят в таблицу. На основании полученных данных вычисляют показатель выживаемости спермиев, и результаты тоже заносят в таблицу. Показатель выживаемости (S) определяют по формуле:

S = Eat,

где Е — знак суммы; а — активность спермиев; t — показатель времени.

Показатель времени определяют по формуле:

 

где Т — продолжительность опыта; Тп + 1 — часы от начала опыта до последующего определения; Тп - 1— продолжительность от начала опыта до предыдущего определения.

Хорошая сперма быка и барана, разбавленная синтетической средой в 16-32 раза, должна иметь показатель выживаемости спермиев более 1400, хряка — 900, жеребца — 400.

Определение процентного соотношения нормальных и патологических форм спермиев.

Среди нормальных спермиев всегда находится более или менее значительное количество патологических форм. Чаще аномалии выявляются в хвостовой части спермиев, основании головки и в шейке. С возрастом к моменту физиологической зрелости производителя количество аномальных спермиев уменьшается. Могут встречаться самые различные патологические формы спермиев: гигантского размера или карликовые, спермин с двумя-тремя головками и общим хвостиком, с двумя хвостиками, с укороченным хвостиком, его деформацией или отсутствием, с протоплазматической капелькой, слишком большой или маленькой головкой и другие формы. Иногда встречаются спермин, лишенные головки, но способные двигаться.

Установлено, что признаки патологических спермиев — слабо  выраженный перфораторий или его отсутствие. Нарушение структуры перфоратория и оболочки спермия является признаком начальных изменений спермиев при их хранении.

Большое количество патологических спермиев свидетельствует о нарушении спермиогенеза при неблагоприятном воздействии инфицированных различной микрофлорой секретов придаточных половых желез и мочеполового канала и указывает на нарушение правил получения спермы и ее хранения.

В качестве конкретных причин образования уродливых форм спермиев отмечают: 1) слабо развитые семенники; 2) поражения семенника и придатка (гигантские и карликовые спермин); 3) длительные промежутки между коитусами, обусловливающие старение и распад спермиев в придатке (отдельные головки, изолированные хвостики); 4) половое истощение производителя вследствие большой половой нагрузки или недостаточного кормления (спермин с протоплазматическими капельками в области шейки, тела и хвоста — незрелые спермин). Чем ближе к головке расположена капелька — тем моложе спермин.

Большую роль в образовании  патологических форм спермиев играет нарушение терморегулирующей функции  мошонки.

Если в сперме жеребца  содержится до 150-300 патологических спермиев на 1000, она считается нормальной. Быки, дающие сперму с содержанием более 18% , а бараны более 14% уродливых спермиев, должны рассматриваться как бесплодные. Значительное количество патологических спермиев следует, безусловно, расценивать как признак наступающей импотенции.

Для определения процентного соотношения нормальных и патологических форм спермиев необходимы следующие материалы и оборудование: сперма; предметные стекла; спиртовая горелка; раствор фуксин-эозина или метиленовой синьки; фильтровальная бумага; пипетки; дистиллированная вода; микроскоп. На мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, чтобы нерастворившиеся кусочки краски не осели на стекло и не мешали подсчету. Раствор краски наливают на бумагу. Краску на стекле смывают водой и высушивают мазок на воздухе. Просохший мазок просматривают под микроскопом при увеличении в 400-600 раз и подсчитывают в нескольких полях не менее 200 спермий.

В каждом поле зрения подсчитывают нормальные и патологические спермин, а затем вычисляют процент их содержания. К числу патологических форм спермиев относят: гигантские и карликовые, с деформацией головки, с двумя головками, надломом шейки, с изолированными головками, с искривленным или закрученным хвостом, с двумя хвостами, утолщением хвоста и пр.

Высокий процент патологических форм спермиев в сперме снижает ее оплодотворяющую способность и может быть одной из причин бесплодия производителей.