Вирус инфекционной анемии лошадей

Патологоанатомические изменения при хроническом течении болезни характеризуются истощением, бледностью и желтушностью слизистых оболочек, наличием мелких кровоизлияний на серозных покровах кишечника, сердца, увеличением селезенки и лимфатических узлов. При латентном течении болезни характерных изменений в трупах не обнаруживают.

Наиболее типичные гистологические изменения заметны в печени и селезенке. В капиллярах печени отмечают скопление гистиоцитов, макрофагов и лимфоидных клеток. В макрофагах и в клетках Купфера обнаруживают гемосидерин, в селезенке — сильное инфильтрирование ткани незрелыми эритроцитами.

3.2. Виды патологического  материала, направляемые от больных  и павших животных.

Для исследования в ветеринарную лабораторию направляют: сыворотку крови лошадей (5-6 мл) для серологического исследования; кровь, которую берут до поения и кормления животного (10-12 мл), стабилизированную 20%-ным раствором цитрата натрия, для гематологического исследования; кусочки печени, селезенки, почек, сердца, легких и лимфатических узлов, взятых от павших или убитых с диагностической целью животных для гистологического исследования; сыворотку крови или дефибринированную кровь от подозрительных по заболеванию инфекционной анемией лошадей для постановки биологической пробы.

Сравнительные показатели крови здоровых и больных лошадей

Гематологические показатели Эритроциты, млн/мкл Гемоглобин, г% СОЭ, мм/ч

Здоровые лошади нормальной упитанности От 5 до 9 7,6 45...60

Лошади, больные инфекционной анемией 4,5 и ниже  5,0 и ниже  66 и более

 

3.3. Этапы лабораторной  диагностики.

Гематологические исследования включают определение числа эритроцитов в 1 мкл крови, содержания гемоглобина и скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

Для гистологического исследования готовят срезы и окрашивают их гематоксилином и эозином и по Перл су (для обнаружения гемосидерина). Наиболее характерные изменения в капиллярах и клетках печени и селезенки: скопление гистиоцитов, макрофагов, лимфоидных клеток и гемосидерина.

В сомнительных случаях для проверки особо ценных лошадей ставят биопробу на жеребятах. Жеребят заражают сывороткой крови или плазмой, взятой от подозреваемых лошадей. За зараженными животными наблюдают 90 дней, через каждые 10-15 дней проводят гематологические и серологические (РДП) исследования. Биопробу считают положительной при наличии у зараженных жеребят характерных клинических признаков: рецидивирующей лихорадки, слабости, желтушности слизистых оболочек, и при получении положительных результатов гематологических и серологических исследований.

Инфекционную анемию следует дифференцировать от пироплазмоза, нутталиоза, трипаносомоза, лептоспироза, гриппа и ринопневмонии.

3.3.1.ПЦР (полимеразно-цепная  реакция)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) – это метод ферментативного получения большого количества копий (амплификации) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити). При этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК, поскольку только этот участок соответствует заданным условиям. И только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических олигонуклеотида - праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из 3’-концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают для разделения двойной спирали, а при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплементарными участками фрагментов ДНК. В результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими двухцепочечными участками - затравками (праймерами). При добавлении нуклеотидов и ДНК-полимеразы синтезируются комплементарные цепи и образуются идентичные фрагменты ДНК. Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием. Таким образом, в процессе реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами.

3.3.2.РНГА (реакция  непрямой гемагллютинации)

Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавливают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Адсорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности. 
 
Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

 

3.3.3.РИФ (реакция  иммунофлуоресценции)

Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии.  Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональые антитела (в случае непрямой РИФ, сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Это заставляет флюорохром  светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

Наибольшее распространение получили наборы, основанные на прямой реакции иммунофлюоресценции (ПИФ), однако имеются тест-системы, использующие реакцию непрямой иммунофлюоресценции.

Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для серодиагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе). В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченной сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Классическими критериями специфичности этой реакции являются:

• характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;
• периферический характер свечения объекта;
• цвет флюоресценции;
• интенсивность флюоресценции.

При исследовании крупных объектов (трихомонады, гарднереллы, клетки пораженные вирусами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный результат. В то же время, элементарные тельца  хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма.

 

3.3.4.Биопроба

При исследованиии сывороток лошадей-продуцентов ставят групповую биопробу. С этой целью из благополучного хозяйства берут 2-х жеребят в возрасте 6-12 мес, 4-кратно, с интервалом 7 дней, их обследуют клинико-гематологически и серологически. Затем жеребят заражают сывороткой крови или плазмой, полученной от больных лошадей. Сыворотку крови и плазму предварительно проверяют на стерильность  и безвредность (на 3-х белых мышах, вводя ее подкожно или внутривенно в дозе 1 мл). Сыворотку вводят жеребятам подкожно или внутривенно в дозе 100-200 мл. За зараженными животными наблюдают 90 дней, через каждые 10-15 дней проводят гематологические и серологические исследования. 
Биологическую пробу считают положительной при наличии у зараженных жеребят характерных клинических симптомов, рецидивирующей лихорадки, слабости, бледности или желтушности слизистых оболочек, исхудания и при получении положительных результатов серологических и гематологических исследований. Жеребят, давших сомнительные результаты клинико-гематологических и серологических исследований, убивают и исследуют патологоанатомически и гистологически. При положительном результате обнаруживают серозно-геморрагическую инфильтрацию подкожной и межмышечной клетчатки, гиперемию и отек лимфоузлов, зернистую или жировую дистрофию скелетных мышц, миокарда, почек, множественные кровоизлияния на слизистых, серозных оболочках и под капсулой органов. 
Селезенка сильно увеличена вследствие кровенаполнения пульпы. Печень гиперемирована, увеличена, с выраженной дольчатостью на разрезе, паренхима имеет мускатный рисунок. Во всех органах появляется реакция ретикулоэндотелиоза. Биопробу считают отрицательной при отсутствии у подопытных жеребят симптомов болезни, отрицательных результатов серологических и гематологических исследований. Групповую биопробу проводят путем заражения двух жеребят смесью сыворотки (плазмы) крови 10-15 лошадей-продуцентов. Смесь вводят подкожно по 100-200 мл каждому жеребенку. 

4.Профилактика и меры борьбы

Основными мероприятиями по профилактике инфекционной анемии являются: строгий ветеринарный контроль за продажей, выводом и перемещением лошадей, своевременная информация о наличии подозрительных по болезни животных, профилактическое карантинирование вновь поступающих лошадей и серологическое исследование РДП. Главным резервуаром вируса в природе служат клинически больные и внешне здоровые — латентно больные лошади. Немедленное изолирование и уничтожение их, ограждение лошадей от покусов насекомыми-гематофагами являются предпосылкой для успешной профилактики борьбы с болезнью. У лошадей, подозреваемых в заражении, ежедневно измеряют температуру тела, 2 раза в месяц подвергают тщательному клиническому осмотру. Этих лошадей можно использовать на работах в пределах карантинированного хозяйства. Мясо убитых лошадей проваривают и скармливают плотоядным и птицам (но не свиньям).

После установления диагноза на ИНАН на хозяйство накладывают карантин и проводят оздоровительные мероприятия согласно инструкции. Лошадей с неясными признаками болезни изолируют и подвергают тщательному клиническому и серологическому исследованию в РДП. После выделения больных лошадей и затем каждые 15 дней до снятия карантина помещения дезинфицируют 4 %-ным р-ром едкого натра. Навоз обезвреживают биотермически в течение 3 мес. Для борьбы с гематофагами применяют инсектициды: лошадей обрызгивают 3 %-ным р-ром креолина (действует в течение 3 — 5 ч). Во время работы  на  лошадях  используют ленточные  защитные пропитанные 10 %-ным р-ром креолина.

Карантин с неблагополучного пункта снимают через 3 мес. со дня последнего случая убоя или падежа больной лошади, при условии, что в хозяйстве не осталось больных животных или вирусоносителей (проводят серологическое исследование в РДП). Продажа или передача лошадей в другие хозяйства разрешается лишь через 3 мес., после снятия карантина и получения отрицательных результатов исследований сывороток крови по РДП.

5.Заключение

Коневодство стран, где регистрируют инфекционную анемию, терпит большой экономический ущерб. Летальность при первичных вспышках болезни колеблется от 20 до 80 %. Особенно больших расходов требует проведение сложных мероприятий по диагностике, профилактике и ликвидации болезни.

Основой профилактики является соблюдение ветеринарно-санитарных мероприятий при комплектовании стада, разведении, содержании, кормлении животных всех видов. Не следует допускать скармливания кормов, загрязненных испражнениями грызунов, и сборных пищевых отходов, не подвергшихся термической обработке.

 

 

6.Список литературы

1. Бакулов И.А. Эпизоотология с микробиологией  Москва: "Агропромиздат", 1998. - 415с.
2. Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А., Е.С. Воронин и др.; Под ред. А.А. Сидорчука. -- М.: КолосС, 2007. -- 671 с
3. Алтухов Н.Н. Краткий справочник ветеринарного врача Москва: "Агропромиздат", 1990. - 574с
4. Гавриш В.Г. Справочник ветеринарного врача, 4 изд. Ростов-на-Дону: "Феникс", 2003. - 576с.