Вирус ньюкаслской болезни

Ненадежным оказался метод  выделения вируса от зараженных иммунных кур: чем выше иммунитет у несушек, тем меньше вероятности выделения  вируса из их эмбрионов. При исследовании большого количества полевых образцов на выделение вируса НБ можно использовать фрагменты ХАО, связанные с яичной скорлупой. Для этого фрагменты  ХАО размером 0,6-1,0 см2 культивируют в среде Игла. Эффективность выделения  вируса 97%. При внесении вируса в  среду культивирования или непосредственно  на ХАО КЭ получены совпадающие результаты.

Заражение культуры клеток. Выделение вируса в культуре клеток осуществляется редко, так как культуральный вирус по Г A-активности значительно уступает эмбриональному. Однако в тех случаях, когда в лаборатории можно получить культуру фибробластов КЭ и специалисты владеют этим методом, его можно применять для выделения и идентификации вируса. Приготовление вирусной суспензии, выращивание и заражение культуры клеток куриных фибробластов производят общепринятым методом.

В зараженной культуре фибробластов КЭ вирус НБ через 48-60 ч вызывает ЦПИ, специфичность которых подтверждается реакцией гемадсорбции с эритроцитами кур. С вируссодержащей культуральной жидкостью может быть поставлена РГ А в отношении эритроцитов крови кур. Обычно при первичном выделении ГА-титр культурального вируса не превышает 1:32 - 1:128. Отсутствие или низкие титры ГА вируса в первом пассаже на культуре ткани не дают основания исключить НБ.

Заражение птиц. Если КЭ под руками нет, вирус можно выделить на неиммунной к НБ птице. Для этого испытуемый материал 1:10 (0,5 мл) внутримышечно инокулируют цыплятам в возрасте 2-4 мес. За инфицированной птицей наблюдают 10-12 дн. При появлении характерных для болезни симптомов птиц в агональном состоянии убивают и берут пробы головного мозга и селезенки, которые можно использовать для заражения КЭ и иммунологической пробы (для одновременного заражения птиц иммунной и неиммунной групп).

Титрование  вируса. Обычно проводят на КЭ, культурах клеток по общепринятой методике и на 6-10 нед цыплятах. Доза инокуляции вируса для цыплят 0,5 мл (внутримышечно или внутривенно). Срок наблюдения 15 дн.

Титрование вирусов 

Под титром вируса понимают выражение его концентрации в  материале. Титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. В вирусологической работе при экспериментальном заражении  или производстве и оценке активности противовирусных и диагностических  препаратов постоянно возникает  необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Количество вируса выражают в единицах действия или единицах активности.

Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов  инфекционные и гемагглютинирующие. В практике используют три типа единиц количества вируса:  
1. Инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту.  
2. Инфекционные единицы 50 % действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статически.  
3. Гемагглютинирующие единицы. 

Методика определения  титра вируса в БОЕ 

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки (островки мертвых, не окрашенных клеток в слое окрашенных живых) в  зараженных культурах клеток, залитых  агаровой средой с красителем нейтральрот  и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими  вирусами.  
Количество вируса при этом может быть измерено, соответственно, в бляшкообразуюших единицах (БОЕ) и оспообразующих единицах (ООЕ): 1 БОЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной бляшки; 1 ООЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной оспины. Методика определения титра вируса в БОЕ (ООЕ) заключается в следующем:  
1.. Точно отмеренными и строго одинаковыми объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов на ХАО.  
2. Подсчитывают количество образовавшихся в каждом матрасе бляшек или в каждом курином эмбрионе оспин.  
3. Рассчитывают среднее арифметическое этого количества, которое равно количеству БОЕ или ООЕ вируса в заражающей дозе вируссодержащего материала.  
4. Титр вируса (Т) рассчитывают по формуле:  
Т = среднее арифметическое количество бляшек (оспин) / объем заражающей дозы х разведение вируссодержащего материала.  
Считается, что счету поддаются бляшки и оспины, если их количество не превышает 50 на матрас или ХАО. Иногда, в случае высокой концентрации вируса в материале, бляшки в культуре клеток или оспины на ХАО могут сливаться, и их невозможно будет сосчитать. В таких случаях готовят несколько десятикратных разведений испытуемого материала и каждым разведением в одинаковых дозах заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов, затем рассчитывают среднее арифметическое количество бляшек или оспин для каждого разведения. Титр вируса в этом случае рассчитывается по более сложной формуле:  
Т = сумма средних арифметических количества бляшек (оспин) в каждом разведении / объем заражающей дозы х сумму разведений вируссодержащего материала 
Метод титрования вирусов в БОЕ дает наиболее достоверные данные о концентрации вирусов, но он встречает технические трудности с подсчетом бляшек. Что касается оспин, то их использование ограничивается довольно немногочисленными вирусами, способными образовывать узелки на ХАО куриных эмбрионов.  

Метод определения  титра вируса в единицах 50 % инфекционного  действия 

Этот метод более универсален. Количество вируса (титр вируса) при  этом измеряется в эффективной 50 % дозе – ЭД50.  
1 ЭД50 = доза вируса, способная вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов.  
Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект - лабораторные животные (обычно белые мыши), куриные эмбрионы или культура клеток. Инфекционный эффект или действие вируса на разных тест-системах может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. У лабораторных животных и куриных эмбрионов действие вируса оценивается в летальной и инфекционной дозах:  
1 ЛД50 - доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных;  
I ЭЛД50 - доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;  
1 ИД50 - доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;  
1 ЭИД50 - доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов.  
В культуре клеток действие вируса оценивается по цитопатическому эффекту или действию (ЦПД):  
1 ЦПД50 - доза вируса, вызывающая цитопатический эффект в 50 % пробирок с зараженной культурой клеток.  
Количество ЭД50 (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, будет выражением титра вируса в этом материале. Так, запись Т = 103.48 ЦПД50 / 0,1 мл означает, что в каждом 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103.48 доз (3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.  

Метод определения  титра вируса в единицах гемагглютинируюшего  действия 

Некоторые вирусы при определенных условиях способны агглютинировать  эритроциты определенных видов животных. Титр таких вирусов можно выразить в гемагглютииирующих единицах (ГАЕ).  
1 ГАЕ = доза вируса, способная агглютинировать около 50 % эритроцитов, содержащихся в том же, что и вирус, объеме 1 % суспензии отмытых эритроцитов.  
Методика определения титра вируса по гемагглютинирующему действию такова:  
1) готовят 1 % суспензию отмытых эритроцитов животных определенного вида;  
2) готовят ряд последовательных 2-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала в плексигласовых пластинах в равных объемах;  
3) ко всем разведениям вируссодержащего материала добавляют 1 % суспензию отмытых эритроцитов в таких же объемах;  
4) смеси выдерживают установленное время при определенной температуре и оценивают интенсивность гемагглютииации в каждой лунке (пробирке) в крестах. То наивысшее разведение вируссодержащего материала, с которым агглютинирует 50 % эритроцитов (не менее чем на два креста), содержит 1 ГАЕ.  
Титр вируса будет больше во столько раз, во сколько раз разведен материал, чтобы получить 1 ГАЕ. Если высшим разведением, дающим гемагглютинацию на два креста, будет 1:128, это значит, что в объеме титрования вируса, разведенного в 128 раз, содержится 1 ГАЕ. В этом случае титр вируса в неразведенном материале равен 128 ГАЕ.

Культивирование

Помимо восприимчивой  птицы вирус культивируется в  КЭ при любом способе заражения, иа изолированных ХАО, в культуре фибробластов КЭ, некоторых первичных  и перевиваемых клетках.

Через 48 ч вирус (шт. R2B) накапливался в значительных количествах в  ХАО и в низких титрах определялся  в аллантоисно-амниотической жидкости. Если эмбрионы инкубируют до 60 ч, то вирус  выходил из ткани мембран и  в больших количествах накапливался в экстраэмбриональной жидкости (15). В клетках ВНК-21 М-белок вируса НБ обнаруживался в цитоплазме с 5-го ч после инфицирования (22). При  совместном культивировании в КЭ шт. La-Sota вируса НБ и шт. ЦНИИПП клон НТ вируса ИЛТ синергизма и интерференции не отмечено, т.е. накопление вирусов было таким же как и при монокультивировании.

Цитопатология заражённой культуры клеток. Вирус развивается в культурах  клеток 18 первичных и 11 перевиваемых линий, вызывая цитологические изменения. Репродукция его в культуре тканей сопровождается уплотнением цитоплазмы клеток, появлением в них вакуолей и вирусных частиц. Через 40 ч в  цитоплазме некоторых клеток обнаруживали множество малых аморфных эозинофильных  включений, окруженных прозрачной зоной. В одной клетке могло быть до 12 (и более) таких включений. Через 2 дня в зараженных культурах увеличивалось  количество клеток с пикнотическим  ядром, а через 7 дн поражались все  клетки.

Определение вирулентности выделенного вируса

Помимо серологической идентификации  часто возникает необходимость  определения вирулентности выделенного  изолята. Это особенно важно в  том случае, когда возникает подозрение, что выделенный возбудитель является штаммом, применяемым для массовой вакцинации. Степень вирулентности  можно определить следующими методами.

Метод  Хенсона - определение индекса внутримозговой вирулентности. Исследуемым материалом в разведении 1:10 заражают интрацеребрально в дозе по 0,05 мл 10 1-дн цыплят, полученных от невакцинированных против НБ кур. Время наблюдения 8 дн. Все погибшие цыплята считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 2. Все цыплята, проявившие клинические признаки, тоже считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 1. Индекс интрацеребральной патогенности вычисляют путем деления суммы балов на 80 (число наблюдений за 10 цыплятами в течение 8 дн). Для лентогенных штаммов индекс до 0,2, для велогенных штаммов - больше 1,5. Недостатком данной методики является - постоянный период наблюдения - 8 дн.

Метод определения  среднего времени гибели 10-дн эмбрионов, вызванный минимальный летальной  дозой (СВГ/МЛД). Для этого готовят серию 10-кратных разведений исследуемого вируса от 10^-1 до 10^-10, пять из них (10^-1, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10 используют для заражения 10-дн КЭ в аллантоисную полость в объёме по 0,1 мл. Каждым из этих разведений инокулируют по 10 КЭ: по 5 заражают в 8 ч утра и 5-в 16ч (в общем заражают 50 эмбрионов) и инкубируют их при 37°С. Наблюдают за ними 2 раза в день через 8 ч в течение 120 ч. Час гибели каждого погибшего эмбриона регистрируют. Минимальной летальной дозой считают самое большое разведение вируса, вызывающее гибель всех инокулированных эмбрионов. Среднее время гибели находят путем деления суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванной минимальной летальной дозой, на число эмбрионов: среднее время гибели до 60 ч - велогенные штаммы; среднее время гибели от 61 до 90 ч - мезогенные штаммы; среднее время гибели от 90 и больше 100 ч - лентогенные штаммы.

Однако методы эти дорогостоящие  и требуют много времени - необходимо затратить по меньшей мере 7 дн для  того, чтобы дифференцировать дикие  штаммы от вакцинных.

РСК. Быстрый и дешевый способ дифференциации штаммов. Диагноз ставят в течение 3 дн после получения проб. Самое слабое связывание комплемента вызывают велогенные дикие штаммы, самое сильное -лентогенные (например La Sota), в границах между сильными и слабыми - мезогенные.

Реакция связывания комплемента (РСК). В РСК помимо антигена и антител принимает участие третий компонент - комплемент, который способен связываться с комплексом антиген-антитело. Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождаются видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитичесчкую систему (эритроциты барана, обработанные гемолитической антисывороткой). В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис эритроцитов. Если в опытной системе образовались комплексы антиген-антитело, которые связывают комплемент, то лизис эритроцитов в индикаторной системе не произойдет (реакция положительная).

Биопроба. Начиная с 1972 г. в США, а затем и в других странах были выделены штаммы с очень высокой вирулентностью. Их называют штаммами WND (висцеро-тропные штаммы НБ). Для идентификации проводится биопроба на восприимчивых цыплятах в возрасте не менее 6 нед. Цыплят заражают в клоаку. Несколько особей заражают в глаз, внося туда каплю вируса. За птицами наблюдают 10 дн. Если в течение этого периода ни один цыпленок не погибает, считают, что штамм не относится к WND. Если же птицы заболеют и погибнут в течение 10 дн, производят вскрытие.

 В США принята следующая  оценка интенсивности изменений  (в баллах):

• точные кровоизлияния или некротические изменения в трахее - 25;
• точечные кровоизлияния или некротические изменения в трахее и сопутствующая им отечность трахеи и в области входа в грудную клетку - 100;
• точечные кровоизлияния или некротические изменения в зобе - 100;
• некроз и изъязвление желез следам кишки и пейеровых бляшек - 100;
• точечные кровоизлияния или некротические измененная слизистой оболочки клоаки - 10; воспаление брюшины в области яичника - 10;
• точечные кровоизлияния в других местах - 10.

Диагностика WND считается  обоснованной, если общее число баллов достигает 150 или более.

Ретроспективная диагностика. Антитела появляются в крови через 6-10 дней после заражения, и максимальный уровень их достигает к 25 - 30 дневному возрасту, а через 8 - 12 месяцев остаются только следовые показатели. При этом используют РТГА, РН, РНГА, РДП, ИФА. Диагноз считается установленным при выделении и идентификации вируса из патматериала. Ньюкаслскую болезнь следует дифференцировать от инфекционного ларинготрахеита, пастереллеза, спирохетоза, гриппа, респираторного микоплазмоза и отравления.Для лабораторной диагностики гриппа птиц, ИБ и НБ используют диагностикумы биофабричного производства. Дифференциация вирусов гриппа, насчитывающих 14 подтипов, и парамиксовирусов, включающих 9 серотипов, возможна только в лаборатории. Особое внимание следует сосредоточить на эпизоотологическом мониторинге при этих болезнях, исследовании парных сывороток и периодическом лабораторном анализе патматериала (5).