Микроорганизмы

Первое доказательство того, что липиды содержат физиологически необходимые для высших животных соединения, получено в 1926 г. голландскими исследователями Ивансом и Буром. Несколько позднее было установлено, что этими соединениями являются полинасыщенные жирные кислоты (линолевая, линоленовая и арахидоновая) – физиологически необходимые для большинства живых организмов (витамин F). 

В дальнейшем было установлено, что и в клетках  микроорганизмов липиды выполняют  самые различные биологические  функции. Они входят в состав таких  ответственных структур, как клеточная  мембрана, митохондрии, хлоропласты и другие органеллы. Липопротеиновые комплексы играют важную роль в процессах метаболизма. С ними в значительной мере связаны активный перенос различных веществ через пограничные мембраны и распределение этих веществ внутри клетки. С составом липидов во многом связаны такие свойства организмов, как термотолерантность и термофильность, психрофильность, кислотоустойчивость, вирулентность, устойчивость к ионизирующей радиации и другие признаки. Кроме того, липиды могут выполнять функцию запасных продуктов. К таковым относятся, поли-β-гидроксимаслянная кислота, образуемая многими бактериями, и ацетилглицерины, в частности триацетилглицерин, накапливаемые в больших количествах некоторыми дрожжами и другими представителями грибов [9].  

В состав природных липидов входят остатки длинноцепочечных спиртов с четным числом атомов углерода. Кроме того, высшие спирты, принимающие участие в образовании молекул липидов, чаще всего имеют неразветвленную углеродную цепь и могут быть как насыщенными, так и ненасыщенными. Наиболее распространены следующие виды спиртов: глицерин – трехатомный спирт, наиболее широко встречающийся полиол в липидах, входит в состав нейтральных липидов и фосфолипидов; диолы – двухатомные спирты, обнаружены и выделены из различных природных источников, входят в состав полярных липидов, распространены значительно меньше, чем глицерин; миоинозит (мезоинозит, i-инозит) – шестиатомный циклический спирт, найден в составе липидов растительных и животных тканей.  

В составе липидов  различного происхождения найдены разнообразные углеводные молекулы, относящиеся к различным классам моносахаридов: гексозы, аминогексозы, дезоксигексозы и др. [10]. 

Распад нейтральных  липидов происходит за счет гидролитического действия липаз. Распад приводит к образованию глицерина и жирных кислот, иногда фосфатов и аминоспиртов. 

Глицерин, образующийся в этой реакции, фосфорилируется  до глицеро-1-р, дегидрируется до диоксиацетон-р  и участвует дальше в процессах  гликолиза. 

Наиболее важную роль при распаде органических веществ играют ферменты – биокатализаторы, образующиеся в клетке и представляющие собой либо простые белки, либо сложные, содержащие не аминокислотные компоненты. Коферменты часто участвуют в переносе электронов или функциональных групп. Как и витамины, они входят в качестве необходимого компонента в пищу и не могут синтезироваться по крайней мере, в органах высших организмов.  

При распаде  жирных кислот в результате β-окисления  на первой стадии, жирные кислоты активируются реакцией с коферментом А (НS-CoA) в присутствии молекулы аденозинтрифосфата (АТФ). Образующийся ацил-СоА постепенно окисляется при помощи дегидрогеназ и гидротаз до β-окси и β-кетокислот, из которых молекула ацетил-СоА («активная уксусная кислота») образуется под действием другой молекулы кофермента СоА со свободной SH-группой. Таким образом, молекула жирной кислоты распадается в конце концов до продуктов, имеющих всего два углеродных атома, превращающихся в цикле трикарбоновых кислот. 

Ацетил-СоА является ключевым промежуточным соединением в превращении всех питательных веществ. Образуется в аэробных условиях из сахаров, аминокислот, липидов (при β-окислении и при гидролитическом распаде глицерина). 

Восстановленные коферменты постепенно окисляются в  дыхательной цепи с постепенным  образованием макроэргических фосфатов. С точки зрения образования АТФ, окисление жирных кислот составляет основной энергетический резерв организма. Если для эукариотов β-окисление происходит в митохондриях, то для прокариотических организмов этот процесс протекает в цитоплазматической мембране [11].  

В организме  жиры локализованы в жировых клетках  и характеризуются высокой скоростью  метаболизма. Приведем реакцию β-окисления  жирных кислот: 

Н3С-СН2-СН2(СН3)-СОSCoA СH3-CH=C(CH3)-COSCoA CH3-CH(OH)-C(CH3)-COSCoA CH3-CO-C(CH3)-COSCoA -OOC-CH(CH3)-COSCoA -OOC-CH2-CH-COSCoA Сукцинат 

В конечном итоге  жирная кислота окисляется до сукцината [12].  

В целом, окисление  липидов можно представить следующей  схемой, представленной на рисунке 1 

Липиды 

  
 

Жирные кислоты, глицерин 

  
 

Ацетил-СоА 
 
 
 
 
 
 

Оксалоацетат  Цитрат 
 
 
 
 
 
 

Малат Изоцитрат 

Фумарат α-Кетоглутарат 
 
 
 
 
 
 

Сукцинат 

Рисунок 1 – Окисление  липидов в цикле Кребса 

Первая стадия в биосинтезе липидов, содержащих жирные кислоты, — образование эфиров жирных кислот и кофермента А. Весь гомологический ряд жирных кислот с длинной цепью, содержащих чётное число углеродных атомов, образуется в результате реакций, называемых малонил-СоА. В этих реакциях к исходной молекуле ацетил-СоА последовательно добавляется звено С-2. Приведём суммарную реакцию синтеза пальметил-СоА: 
 

7СООН—СН2—СО—SКоА  + 14НАДФН2        СН3(СН2)14СООН + 

+ 7СО2 + 8КоАSН  + 14НАДФ + 6Н2О 

При первой реакции  образуется малонил-СоА (путей синтеза  несколько). Один из путей — реакция, катализируемая биотинсодержащим ферментом ацетил-СоА-карбоксилазой: 

Н—СН2—СО—SКоА + СО2 + АТФ        НООС—СН2—СО—SКоА+АДФ + Фн     

У дрожжей система  синтеза жирных кислот представляет собой гомогенный многоферментный  комплекс с молекулярной массой около 2-3 млн. (так называемая синтетаза жирных кислот). 

Образование жирных ненасыщенных кислот у аэробных микроорганизмов  происходит по следующей схеме: 

СН3(СН2)14—СО—SСоА  пальметил-СоА 

          О2 НАДФН2  

СН3(СН2)5СН = СН(СН2)7 —СО—SСоА            пальмитолеил-СоА 

  

Дополнительные  двойные связи могут быть введены  в эфир СоА и мононенасыщенной кислоты в сходной реакции, которая  может быть катализирована тем же ферментом. 

У многих бактерий обычный путь образования жирных ненасыщенных кислот — анаэробный, при котором происходит постепенное удлинение уже ненасыщенных предшественников. Кислоты, содержащие циклопропановые кольца, синтезируются путём образования метиленового мостика по месту двойной связи в ненасыщенных кислотах, при этом добавлямый кислород заимствуется из метильной группы метионина в форме S-аденозилметионина. Это добавление имеет место только при включении в фосфолипид с одной двойной связью [13]. Реакция биосинтеза липидов протекает с выделением углекислого газа и смещением равновесия вправо, то есть является термодинамически устойчивым процессом [14].  

Одним из промышленно  важных ферментов, продуцируемых микроорганизмами, являются липазы, которые интенсивно исследуются во всем мире. Липаза - триглицеридгидролаза - фермент, катализирующий гидролиз жиров, широко распространена в природе. Она присутствует в животных и растительных клетках, а также в микроорганизмах. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что микробные липазы являются ферментами с широкой специфичностью и большим разнообразием свойств. Свойства липаз и характер липолитической активности даже у одного рода можно различно варьировать. Изучение микробных липаз представляет большой теоретический и практический интерес, так как они могут быть использованы при гидролизе разнообразных жировых субстратов [15].  

Липазы катализируют гидролиз жиров и масел с образованием диацилглицеридов, моноацилглицеридов, глицерина и жирной кислоты. Катаболизм включает три основных фазы превращения  органических веществ органотрофами. В первой фазе, с помощью экзоферментов бактерии гидролизуют липиды до жирных кислот и глицерина, которые могут легко транспортироваться в цитоплазму. Во второй фазе, поступившие в цитоплазму органические вещества расщепляются до фрагментов, содержащих два-три углеродных атома. В третьей фазе эти соединения окисляются до углекислого газа и воды. Наибольшая часть энергии высвобождается во второй и третей фазах [11].  

Липазы можно  разделить на две группы: специфичные  и неспецифичные. Ферменты из первой группы гидролизуют сложноэфирные связи в первом или втором положении. Многие микробные липазы обычно гидролизуют первичные сложноэфирные связи (a-эфирные связи). В гидролизиатах с участием таких ферментов обычно обнаруживаются жирные кислоты, 2,3- и 1,2-диглицериды, 2-моноглицериды. При более длительных гидролизах жирнокислотный остаток из 2-моноглицерида мигрирует в первое положение с образованием 1-моноглицерида, который легко гидролизуется специфичной липазой с образованием глицерина и жирной кислоты. К этой группе относятся липазы из Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus microsporus, Mucor miechei, Aspergillus niger, Pseudomonas sp. и т.д. Липазы второй группы не различают эфирные связи во всех трех положениях триглицеридной молекулы и способны подвергать субстрат тотальному гидролизу. В гидролизатах триглицеридов с участием этих видов липаз обнаруживаются, как правило, остатки триглицеридов (негидролизованная часть), глицерин и жирные кислоты. Такие липазы были выделены из Geotrichum candidum, Oospora lactis, Humicola lanuginosa и т. д. Активность липаз зависит от длины цепочки и степени насыщенности жирной кислоты. Дженсон описал, что липаза Geotrichum candidum проявляла высокую специфичность к олеиновой и линолевой кислотам независимо от их положения в молекулах триглицеридов. Такими же свойствами обладают липазы из Achromobacter lipolyticum, тогда как липаза из Aspergillus niger проявляла большую специфичность к стеариновой кислоте и молекулам субстратов [16].  

Важное значение при исследовании жиров приобрели  спектральный метод, метод радиоактивных изотопных индикаторов, молекулярные перегонки и др. Все они представляют интерес, так как для их осуществления требуется очень небольшое количество исследуемого материала, а точность результатов очень высока. 

Спектральный анализ при исследовании жиров проводят в видимой области спектра с длиной волн 400—750 нм, в ультрафиолетовой области с длиной волн 200—400 нм и в инфракрасной области с наибольшей длиной волн 2000—15000 нм. 

Спектральный  анализ применяется для количественного определения в жирах ненасыщенных кислот, некоторых продуктов окисления жира, синтетических ингибиторов окисления жиров и для многих других целей. 

В состав большинства  натуральных жиров и масел  входят ненасыщенные кислоты с изолированными двойными связями. Поэтому для определения содержания в них линолевой и линоленовой кислот смесь кислот изомеризуют.  

Инфракрасная  спектрометрия применяется для  установления деталей строения структурных  элементов жиров, строения сопутствующих  жирам веществ, для определения содержания в гидрированных и модифицированных жирах транс-изомеров олеиновой кислоты, для определения содержания первичных и вторичных спиртов в смеси и для других целей. 

Хроматография — метод разделения веществ, заключающийся  в пропускании газовых смесей или растворов через слой пористых сорбирующих материалов. 

Хроматографический  анализ получил большое применение для разделения и количественного  определения сопутствующих жирам  веществ, жирных кислот, продуктов окисления  жиров, высокомолекулярных жирных спиртов и для многих других целей. 

В области исследования жиров наиболее широко распространены адсорбционная и распределительная  хроматография. В последнее время  широкое распространение в исследовании липидов получила газо-жидкостная хроматография. 

Газо-жидкостная хроматография отличается от других видов распределительной хроматографии  в основном тем, что в качестве подвижной фазы используется инертный газ (гелий, водород), а неподвижной  фазой является жидкость, нанесенная на твердый носитель. Разделение смеси на индивидуальные вещества производится в колонке, заполненной порошком, например, кизельгуром, цеолитом, равномерно пропитанным небольшим количеством нелетучей жидкости, служащей неподвижной фазой.