Контрольная работа по «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции»

Биотехнологии, основанные на достижениях микробиологии, наиболее экономически эффективны при комплексном их применении и создании безотходных производств, не нарушающих экологического равновесия. Их развитие позволит заменить многие огромные заводы химической промышленности экологически чистыми компактными производствами. Важным и перспективным направлением биотехнологии является разработка способов получения экологически чистой энергии. Получение биогаза и этанола были рассмотрены выше, но есть и принципиально новые экспериментальные подходы в этом направлении. Одним из них является получение фотоводорода:

 «Если из  хлоропластов выделить мембраны, содержащие фотосистему 2, то на  свету происходит фотолиз воды  разложение ее на кислород  и водород. Моделирование процессов  фотосинтеза, происходящих в хлоропластах, позволило бы запасать энергию Солнца в ценном топливе водороде».

Широкое использование  микроорганизмов не может не порождать  новых взаимоотношений с живой  природой, что вполне естественно  ведет к желанию осмыслить  сами эти взаимоотношения и соотнести  их со сложившимися представлениями, с одной стороны, о роли живой природы в жизнедеятельности человека, а с другой - о роли человека в биотическом круговороте биосферы.

Имеющийся пока не слишком богатый опыт развития биотехнологии все-таки содержит в  себе много непривычного и вместе с тем многообещающего для возможной оптимизации человеческой жизнедеятельности. А остро вставшая перед Homo sapiens проблема самосохранения вынуждает его к лихорадочным поискам возможных вариантов стратегии своей жизнедеятельности. Этому привлечению природы, причем именно мира микроорганизмов, и положила начало новая биотехнология. Можно, видимо, сказать, что биотехнология в совокупности с другими научными направлениями открывает новую эру взаимодействия человека с окружающей средой и, особенно, с живым веществом биосферы.

Явившись прямым результатом научных разработок, биотехнология оказывается непосредственным единением науки и производства, еще одной ступенькой к единству познания и действования, еще одним  шагом, приближающим человека к преодолению внешней и к постижению внутренней целесообразности». И все-таки она является только небольшим шагом. Поскольку, как заметил Б. Шоу, наука всегда ошибается. Она никогда не разрешает какой-то проблемы, не создав еще десять новых.

Биотехнология сама оказывается всего лишь крупной индустрией, соединением технических и биологических элементов и, естественно, наследует отрицательные свойства уже существующего индустриально-промышленного комплекса. Их действительное преодоление и решение проблемы человека предполагают выход человечества на новые, более совершенные ступени социально-культурного развития, основанного на новых способах познания и действования. Поэтому весьма существенное значение приобретает проблема выбора стратегии взаимодействия человека и природы: или это самонадеянное управление природой или же сознательное и целенаправленное приспособление всей жизнедеятельной деятельности, к существующему биотическому круговороту биосферы

  2.Конструирование ДНК   и введение ее в клетку.

Непосредственное  конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой ДНК с  ДНК-вектора, используют ДНК-лигазу (рис. 227). Лигирование будет успешным, если смыкаемые структуры обладают 3'-гидроксил и 5'-фосфатной группами и если эти группы расположены  соответствующим образом одна относительно другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате са-мокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие ре-стриктазы, такие как Eco R I, продуцируют «липкие» концы, состоящие из 4-х оснований. Процесс лигирования «липких» концов, состоящих из четырех оснований, происходит при пониженной температуре (до 12°С).

Если при  рестрикции образуются фрагменты без  «липких» концов, то их «насильственно» конвертируют в молекулы с

 «липкими»  концами, используя фермент трансферазу.  Этот фермент добавляет нуклеотиды  к 3'-концу ДНК. На одном фрагменте  может быть добавлен поли-А-хвост,  на другом — поли-Т-хвост. Для  генерации любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15—20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.

После смыкания интересующего фрагмента ДНК (гена) с генетическим вектором с помощью  ДНК-лигазы образованные реком-бинантные  молекулы вводят в клетки с целью  добиться их репликации (за счет генетического вектора) и увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором служит плазмида, является трансформация Е. coli. С этой целью бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием или рубидием (ионами) для того, чтобы они стали «компетентными» в восприятии рекомби-нантной ДНК.

Чтобы повысить частоту проникновения ДНК в  клетки, используют метод электропорации, заключающийся в кратком экспонировании клеток в интенсивном электрическом поле. Эта обработка создает полости в мембранах клеток, что способствует лучшему восприятию клетками ДНК- После введения рекомбинантных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА, обогащенный антибиотиками для селекции желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота трансформации является невысокой. Обычно один трансформант возникает на 106 высеянных клеток. Если же вектор является фаговым, то прибегают к трансфекции клеток (бактерий или дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию осуществляют ДНК в присутствии химических веществ, облегчающих прохождение ДНК через плазматические мембраны. Возможны также прямые микроинъекции ДНК в овоциты лягушек, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

Важнейшим моментом, связанным с молекулярным клониро-ванием, является поиск способа, позволяющего установить, действительно ли клонируемый  фрагмент включился в вектор и  вместе с вектором, образовав рекомбинантную молекулу ДНК, вошел в клетки. Если речь идет о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. Например, в плазмидном векторе pBR322, детерминирующем резистентность к ампициллину и тетрациклину, единственный сайт для рестриктазы Pst I находится в локусе, занимаемом геном резистентности к ампициллину. Pst I —плавление на этом сайте генерирует липкие концы, позволяющие лигирование клонируемого фрагмента с векторной ДНК. Однако при этом плазмидный (векторный) ген ампициллинрезис-тентности инактивируется, тогда как ген тетрациклинрезистентнос-ти на векторе остается интактным. Именно, ген тетрациклинрезис-тентности и используется для селекции клеток, трансформируемых рекомбинантными молекулами ДНК. Чтобы убедиться, что клетки выросших колоний на среде с тетрациклином действительно содержат рекомбинантные молекулы ДНК, их проверяют с помощью так называемого «спот-теста» на паре чашек с плотной средой, одна их которых содержит ам-пициллин, тогда как другая лишена этого антибиотика. Клонируемые ДНК содержатся лишь в трансформантах, резистентных к тетрациклину (рис. 228). Что касается трансформантов, резистентных одновременно к ампициллину и тетрациклину (АрТс), то они содержат плазмидные (векторные) молекулы, которые спонтанно приобрели кольцевую форму без включения в них чужеродной (клонируемой) ДНК. Другой способ обнаружения инсерции чужеродных (клонируемых) фрагментов в плазмидный вектор основан на использовании вектора, содержащего ген (3-га-лактозидазы. Инсерция чужеродной ДНК в этот ген неизбежно инак-тивирует синтез р-галактозидаза, что может быть обнаружено посевом трансформированных клеток на среду, которая содержит субстраты р-галактозидазы. Эта среда позволяет селекцию окрашенных колоний клеток.

Как уже отмечено, рестрикционные линейные фрагменты  векторной ДНК способны к восстановлению кольцевой структуры без включения  в них клонируемых сегментов. Чтобы уменьшить частоту спонтанного  образования таких кольцевых  молекул векторной ДНК, рестрикты векторной ДНК обрабатывают фосфатазой. В результате этого образование кольцевых молекул ДНК становится невозможным, поскольку будут отсутствовать концы 5'-РО^, необходимые для действия лигазы.

Совокупность  колоций-трансформантов, выросших на селективной среде, представляет собой совокупность клеток, содержащих клоны разных фрагментов (генов) клонируемой геномной или кДНК. Коллекции этих клонов формируют так называемые библиотеки ДНК, широко используемые в генно-инженерных работах.

Заключительной стадией клонирования генов является выделение и исследование клонированной ДНК, включая секвениро-вание.

          Перспективные штаммы бактерий или соматических клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, которые контролируют синтез интересующих белков, имеющих коммерческую ценность, передают в промышленность.

3.Технология  производства водорослей Spirulina рlatensis и Spirulina maxima.

Спирулина (Spirulina platensis) – одноклеточная  сине-зеленая  водоросль, одно из древнейших на Земле  растений. Возраст спирулины оценивают по-разному: от 700 млн. до 3,5млрд лет. Открытие уникальных свойств спирулины как всегда произошло случайно. В 1964 году бельгийский ботаник Ж. Леонар обнаружил в африканских лесах вблизи озера Чад небольшое племя аборигенов, уклад жизни которых не менялся на протяжении последних нескольких десятков, а может быть и сотен тысяч лет. Эти мирные люди не занимались ни охотой, ни земледелием. Все, что им было необходимо, они находили вокруг себя — эти дикие леса изобилуют фруктами, ягодами, кореньями и другой пищей. Современная цивилизация им была незнакома.

Свое шествие спирулина (Spirulina platensis) начала из Африки — население  района озера Чад давно употребляет  ее в пищу, называя этот продукт  «дихе». Другое место, откуда начала распространяться спирулина, но иного вида (Spirulina maxima) — воды озера Тескоко в Мексике. Еще ацтеки собирали с поверхности озер и употребляли в пищу слизистую массу сине-зеленой водоросли спирулины. Впервые галеты "текуитлатл" упомянуты испанцем Кастильо в 1521 г. Эти галеты продавались на базаре в Мехико и состояли из высушенных слоев S.maxima. В 1964 году бельгийский ботаник Ж.Леонар обратил внимание на галеты сине-зеленого цвета, которые местное население изготовляло из водорослей, растущих в щелочных прудах вокруг озера Чад. Эти галеты представляли собой высушенную массу спирулины. Анализ образцов Spirulina показал, что в ней содержится 65% белков (больше, чем в соевых бобах), 19% углеводов, 6% пигментов, 4% липидов, 3% волокон и 3% золы. Для белков этой водоросли характерно сбалансированное содержание аминокислот. Клеточная стенка этой водоросли хорошо переваривается. Как озеро Тескоко, так и водоемы района озера Чад имеют в воде очень высокое содержание щелочей. Характерно, что в таких озерах спирулина полностью доминирует и растет почти как монокультура — составляет в отдельных озерах до 99 % общего количества водорослей. Растет спирулина в щелочной среде при рН вплоть до 11. Ее собирают также из озер около г. Мехико, получая до 2 т сухого веса биомассы водоросли в сутки, и эта продукция рассылается в США, Японию, Канаду. В других странах спирулину культивируют обычно в искусственных водоемах или специальных емкостях. Спирулину можно культивировать в открытых прудах или, как в Италии, в замкнутой системе из полиэтиленовых труб. Урожайность очень высокая: получают до 20 г сухой массы водоросли с 1 м2 в день, а расчеты на год показали, что она превысит выход пшеницы примерно в 10 раз.

В процессе эволюции, проходя  жесткие условия конкуренции, клетки Spirulina рlatensis и Spirulina maxima приобрели способность к делению при благоприятных условиях с огромнейшей скоростью – удвоение биомассы за пять часов. Этот факт можно проиллюстрировать так: при правильном культивировании Spirulina рlatensis и Spirulina maxima они растет настолько быстро, что может обеспечить в 20 раз больше протеинов с единицы культивационной площади, чем соя, и в 200 раз больше, чем говядина. Она не нуждается в черноземе, в то время как на получение 1 кг кукурузного протеина уходит 22 кг поверхностного почвенного слоя, а на получение 1 кг говяжьих протеинов — 45 кг зеленой массы. Благодаря своим ценным биологическим и физиологическим свойствам, биомасса Spirulina рlatensis и Spirulina maxima вот уже около полувека — является предметом бизнеса во многих странах мира. Так, годовое производство спирулины в 2005 г в Мексике составило 183 тонн, в Японии – 190 тонн, в Индии и Китае – по 170 тонн. Поначалу сбор спирулины проводили непосредственно в природных щелочных водоемах Африки и Америки, в которых из-за их удобного географического положения и химического состава воды сложились благоприятные условия для роста Spirulina рlatensis и Spirulina maxima.

В дальнейшем потребность  в спирулине стала возрастать, что привело к разработке новых  технологий выращивания спирулины в искусственных водоемах.

В последние годы появился ряд серьезных технологических  разработок в области культивирования  спирулины. Благодаря отдельным  ноу-хау, техническим и технологическим  решениям, продуктивность спирулины  можно увеличить в 5-10 раз (!) по сравнению с известными аналогами. Причем, качественный состав ее в этом случае далеко превосходит состав биомассы, полученной в условиях тропиков или добытой в природе. Кроме того, эта спирулина отличается высокой чистотой и концентрацией биомассы.

Существует несколько  различных технологий культивирования  спирулины – массовая культура под  открытым небом в бассейнах при  искусственном освещении, интенсивное  культивирование в стеклянных тубах, теплицах, а также в замкнутых  аппаратах по типу современных микробиологических производств. Примером таких закрытых установок есть фотореакторы каскадного типа, позволяющие выращивать очень чистую спирулину с использованием как искусственного, так и естественного освещения.

Разработанный способ отбора клеток спирулины из питательного раствора, дает возможность отбирать наиболее зрелые клетки и не допускает перезревания культуры. Специальная сушка позволяет обеспечить свежесть и чистоту водоросли, сохранить ее биологическую активность, а возможность использования солнечного света дает экономию более 80% электроэнергии.