Изучение свойств и методик определения витамина Р

2.3.3. Оптические методы  определения флавоноидов.

Спектрофотометрический и фотоколориметрический анализы являются разновидностями молекулярно-абсорбционного спектрального анализа. Сущность молекулярно-абсорбционного спектрального анализа заключается в качественном и количественном определении веществ по их спектрам поглощения. Физической основой спектрального анализа является взаимодействие электромагнитного излучения с веществом.

Основной закон спектрофотометрии - закон Бугера-Ламберта-Бера. Применительно к растворам его запись выглядит следующим образом:

,

(1.4)

 

где, 10 – начальная интенсивность светового потока,

I - интенсивность  светового пучка после прохождения  раствора,

ε – коэффициент поглощения (экстинкции) светового потока,

С – концентрация вещества в растворе в моль/л,

l – толщина слоя светопоглощающего раствора.

 

Из уравнения (1.4) следует:

 

,

(1.5)

 

 

Величина lg (I0/I) называется оптической плотностью раствора и обозначается символом D. Из (1.5) имеем:

 

(1.6)

 

Из уравнения (1.6) следует, что оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации светопоглощающего вещества в растворе и толщине слоя раствора. То есть при определённой толщине слоя раствора, оптическая плотность будет тем больше, чем больше концентрация вещества в растворе. Отсюда следует, что, определяя оптическую плотность раствора, мы можем напрямую определять концентрацию вещества в растворе. Увеличивая толщину слоя l можно измерять очень малые концентрации веществ [10,19].

Количественное определение исследуемых флавоноидных соединении в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотомерии или дифференциальной спектрофотомерии является одним из наиболее распространенных методов анализа флавоноидов. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы для флавоноидов – 330-370 нм, так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой «площади» вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет ± 2-5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0.5-1.0 %. Рабочий интервал концентраций спиртовых, спиртоводных растворов составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений и не позволяет судить о их количестве.

Спектрофотометрические или фотометрические определения по реакции диазотирования ранее были широко распространены в анализе. Реакция чувствительна, но не избирательна, так как наряду с флавоноидами эту реакцию дают фенольные соединения, пиразолоны и другие классы соединений. Применение данного метода ограничено неспецифичностью его и внутри каждого из классов соединении из-за прохождения реакции у флавоноидов только по кольцу А при наличии свободного ортоположения по отношению к фенольному гидроксилу у 7-го углеродного атома. Поэтому даже суммарные определения с данным реактивом не показывают истинного содержания исследуемых веществ как в суммарных фитохимических препаратах, так и в растительном сырье.

Большей специфичностью обладают, хотя и не лишены недостатков, методики определения флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), азотнокислым галлием. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотнокислым галлием. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением азотнокислого галлия, позволяющая количественно определять 0.5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония – 0.9-1.0 мкг и с хлористым алюминием – 1-2 мкг.

Описаны методики анализа флавоноидов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при длине волны 575 нм, а также с цинком и мышьяком. Получить истинное суммарное содержание флавоноидов по образованию цветных комплексов с металлами возможно лишь при наличии у соединений одинакового количества комплексообразующих центров. Отсутствие таковых у целого ряда соединений приводит к отрицательной реакции с данными реактивами.

Несмотря на указанные недостатки, метод нашел широкое применение при установлении суммарного содержания флавоноидов в сырье и суммарных фитохимических препаратах. В качестве стандарта используют кверцетин, кемпферол или их гликозиды.

Широко распространена при определении общего количества флавоноидных соединений в растениях методика фотометрического определения по реакции комплексобразования с борной кислотой при длине волны 470 нм. Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексобразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений. В качестве образцов используют как агликоны, так и гликозиды флавонов, флавонолов, халконов. Рабочая концентрация растворов 1-10 мкг/мл. Относительная ошибка определения ± 3.35 %.

Одним из методов определения флавоноидных соединений по оптической плотности является также анализ продуктов взаимодействия с 4-аминоантипириновым реактивом. Однако, данный анализ требует соблюдения ряда условий, как и при реакции диазотировання, и не является избирательным.

В ряду спектрофотометрических методов анализа флаванонов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0.5-1 мкг/мл при длинах воли 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов.

Комплексонообразующие свойства флавоноидов положены в основу флуорометрического метода, являющегося на порядок более чувствительным, чем спектрофотометрический. Количественно оценить флавоноиды этим методом возможно при наличии 0.05-1 мкг вещества в 1 мл раствора. Высокая чувствительность флуорометрического метода раскрывает широкие возможности его применения для предварительной идентификации биологически активных веществ в тканях растений. Однако получить объективные результаты при анализе сырья и фитохимических препаратов можно только после разделения веществ с помощью различных видов хроматографии [19].

 

2. Метод определения витамина Р

Метод основан на окислении дубильных веществ  KMnO4. Комплекс флавоноидов экстрагируется из объектов  дис. H2O.

Водные растворы титруют 0.1 Н KMnO4 в присутствии индикатора индигокармина. Результаты титрования сравнивают со стандартом.

3.1. Ход работы.

Навеску объекта заливают 100 мл. нагретой до кипения Н2О и кипятят в течении 5 мин. В колбе с обратным холодильком. Полученный экстракт охлаждают и отбирают 2 мл, перенеся  в колбу с 45 мл. Н2О дист.. так же в колбу капают пару капель индигокармина, в результате  чего содержимое колбы окрашивается в интенсивнй синий цвет.

Исследуемый раствор титруют 0,1 Н раствором KMnO4 до появления желтой окраски, через переходные тона; от синего до зеленовато-желтого.

Для контроля титруют пробирку с 47 мл. Н2О, с добавленным в нее индигокармином.

Разница между опытом и контролем представляет: количество мл. 0,1 Н KMnO4 идущего на окисление катехинов. Расчет производят по формуле:

 

3.1.2. Результаты исследования

Для моего исследование был взят, витаминно-минеральный препарат «Комплевит»-ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» в котором  содержание витамина Р= 25,00 мг на 1 таблетку.

При практическом применении методики определения витамина Р получились результаты:

 

Такое содержание витамина рассчитано на 100 мл. раствора.

 

3.1.3. Примечание:

Переводной коэфициент был взят 2,41, т.к. концентрация KMnO4 ,была не 0,1 Н, а меньше.

 

3.2. Вывод

Применение  различных методик определения витамина, должна быть сконцентрирова на высокую точность. В моем случае высокая погрешность измерения была определена тем,  что:

- Была нарушена исходящая концентрация  KMnO4.

- Не достаточное количество  раз проделывания опыта.

- Погрешность при приливании, переливании растворов.

- Погрешность при экстрагировании.

- Нарушения при установлении внешних условий проделывания опыта.

Несмотря на то, что результаты получились намного завышены. Методы определения количественных и качественных показателей витамина Р являются достаточно точными, и дают 90%информации.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованных источников

   

1. Яковлева, Г.П. Лекарственное сырье животного и растительного происхождения. Фармакогнозия./ Г.П. Яковлева – Спб.: Спецлит, 2006. – 845с.
2. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – М.: Медицина, 2002
3. Биологически активные вещества растительного происхождения / Б.Н. Головкин, Р.Н. Руденская, И.А. Трофимова, А.И. Шретер. – М.: Наука, 2002
4. Химия растительного сырья №4. – 2007. – 73-77 с.
5. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия: учебник для высш. шк. / В.Г.Беликов – М.: МЕДпресс-информ, 2007. – 624 с.
6. "Технология сушки: Учебно-методический комплекс", Киселева Т.Ф. – /Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. – Кемерово, 2007. – 117 с.
7. Кузнецова М.А. Лекарственное растительное сырье./М.А Кузнецова. – М.: Высш. шк., 1984. - 207с.
8. Корулькин, Д.Ю. Природные флаваноиды /Д.Ю. Корулькин, Ж.А. Абилов, Г.А. Толстиков. – Новосибирск: Наука, 2007. – 296с.
9. Каухова, И. Е. Особенности экстрагирования биологически активных веществ двухфазной системой экстрагентов при комплексной переработке лекарственного растительного сырья / И. Е. Каухова // Растительные ресурсы. – 2006. – Т. 42. – Вып. 1. – С. 82-91.
10. Георгиевский, В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В. П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. – Новосибирск: Наука, 1990. – 144с.
11. Дегтярев, Е. В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе БАВ / Е. В. Дегтярев, Б. В. Тяглов, В. Д. Красиков, А. В. Гаевский // 100 лет хроматографии. – М.: Наука, 2003. – 124с.
12. Кирхнер, Ю. В. Тонкослойная хроматография / Ю. В. Кирхнер. – М.: Мир, 1981. – 542с.
13. Органическая химия: учебник для вузов: В 2 кн. Кн.2: Специальный курс/ Н.А. Тюкавкина, С.Э. Зурабян, В.Л. Белобородов и др.; под ред. Н.А. Тюкавкиной. – М.: Дрофа, 2008. – 592с.
14. Сычев, С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии «Милихром»: Монография/ С.Н. Сычев, К.С. Сычев, В.А. Гаврилина. – Орел: ОрелГТУ, 2002. – 134с.
15. Васильев, В. П. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа: учеб. для студ. вузов, обучающихся по химико-технол. спец. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Дрофа, 2002. – 384 с.
16. Лебедева, М.И. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа: учеб. пособие/ М.И. Лебедева. – Тамбов: ТГТУ, 2005. – 216с.
17. Абдуллабекова, В.Н. Идентификация рутина в растительном сырье методом капиллярного электрофореза/ В.Н. Абдуллабекова// Вестник фармации. – 2009. – №3. – С.23-28.
18. Духин, С.С. Электрофорез/ С.С. Духин, Б.В. Дерягин. – М.: Наука,1976
19. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа/ Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А. Золотова. – М.: Высшая школа, 2002. – 494 с.
20. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хроматомасспектрометрию: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 237 с.
21. www.goodhealth.ru/articles/properties-vitamins-next  
22. http://obad.ru/registrbad/flavopektin-21967.html