Энзимология как учение о ферментах. Простые и сложные ферменты

 

 

Рисунок 3.1. Энергетические барьеры катализируемой и некатализируемой реакций.

 

В любой совокупности молекул того или иного вещества индивидуальные молекулы при постоянной температуре сильно различаются по количеству содержащейся в них энергии. Лишь небольшая часть их может преодолеть активационный барьер и вступить в реакцию в отсутствие катализатора. Поэтому скорость реакции в таких условиях будет очень низкой.

 

Фермент, соединяясь с субстратом, образует короткоживущий фермент-субстратный комплекс (рисунок 3.2), которому соответствует более низкая энергия активация по сравнению с субстратом в некатализируемой реакции; такой энергией обладает уже значительно больше молекул субстрата. По завершении реакции фермент-субстратный комплекс распадается на продукт (или продукты) и фермент. Фермент по окончании реакции остаётся таким же, как был до неё, и может взаимодействовать с новой молекулой субстрата.

 

 

Рисунок 3.2. Образование фермент-субстратного комплекса в ходе катализируемой реакции.

 

Именно таким образом ферменты снижают энергетический барьер реакции: в их присутствии гораздо большее число молекул вступает в реакцию за единицу времени.

 

Активный центр фермента

 

В процессе формирования фермент-субстратного комплекса субстрат присоединяется к специфическому участку на молекуле фермента, который называется активным центром.

 

Активный центр – участок молекулы фермента, который связывает субстраты и от которого зависит специфичность каталитического действия ферментов; активный центр содержит функциональные группы остатков аминокислот и коферментов, пространственно сближенных и определённым образом ориентированных.

 

Несмотря на огромное разнообразие структуры ферментов, их специфичности и механизма действия, существует ряд общих закономерностей формирования активных центров.

 

Во-первых, на активный центр приходится относительно малая часть объёма фермента. Роль остальных аминокислотных остатков, составляющих основную массу фермента, состоит в том, чтобы обеспечить молекуле фермента правильную глобулярную форму.

 

Во-вторых, активный центр – это сложная трёхмерная структура, и в её образовании принимают участие группы, принадлежащие разным частям линейной последовательности аминокислот. Радикалы аминокислот, образующих активный центр, оказываются вблизи друг от друга в результате формирования третичной структуры белка (рисунок 3.3). Поэтому при воздействии факторов, вызывающих денатурацию (нагревание, концентрированные кислоты и щёлочи) утрачивается конформация активного центра и фермент теряет свою активность.

 

 

Рисунок 3.3. А. Участие аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента, во взаимодействии с субстратом. Б. Положение этих аминокислотных остатков в первичной структуре фермента.

 

В-третьих, активный центр имеет форму узкого углубления или щели, в которую ограничен доступ воде, за исключением тех случаев, когда вода является одним из реагирующих веществ. В этом углублении присутствует несколько полярных аминокислотных остатков, необходимых для связывания субстрата и катализа.

 

В-четвёртых, в составе активного центра можно условно выделить две части: а) контактный или якорный участок, где происходит связывание субстрата в нужной ориентации; б) каталитический участок, обеспечивающий протекание реакции.

 

 

Рисунок 3.4. Состав активного центра фермента (на примере химотрипсина).

 

В-пятых, субстраты относительно слабо связываются с ферментами. В связывании и превращении субстрата принимают участие следующие группировки аминокислотных радикалов:

полярные заряженные: карбоксильные группы глутамата и аспартата, аминогруппы лизина; гуанидиновые группы аргинина; имидазольные группы гистидина;

полярные незаряженные: гидроксильные группы серина и треонина; сульфгидрильные группы цистеина; фенольные группы тирозина;

неполярные группы: углеводородные цепи алифатических аминокислот; ароматические кольца фенилаланина и триптофана.

 

У сложных ферментов в формировании активных центров принимают участие также функциональные группы коферментов.

 

В образовании фермент-субстратных комплексов принимают участие те же молекулярные взаимодействия, что и обеспечивают формирование пространственной структуры макромолекул, межклеточные контакты и другие процессы в биологических системах:

водородные связи между полярными незаряженными группировками субстрата и фермента;

ионные связи между противоположно заряженными группировками субстрата и фермента;

гидрофобные взаимодействия между неполярными группировками субстрата и фермента.

 

Эти три основных типа нековалентных связей различаются по своей геометрии, энергии, специфичности.

Раздел 3.3 

Взаимодействие активного центра с субстратом: модели жёсткого и индуцированного соответствия.

 

 

Cпецифичность  связывания субстрата с ферментом зависит от строго определённого расположения атомов в активном центре. Субстрат входит в активный центр, если он соответствует ему по форме. Существует две модели, описывающие взаимодействие субстрата с активным центром:

 

1. Модель  жёсткого соответствия («ключ – замок»), предложена Э. Фишером в 1890 году. Активный центр считается заранее подогнанным под форму молекулы субстрата (рисунок 3.5). Эта модель не утратила своего значения для понимания некоторых свойств ферментов, например, их способности к строго определённому связыванию двух или большего числа субстратов или для объяснения кинетики насыщения субстратом.

 

 

Рисунок 3.5. Взаимодействие субстрата с ферментом согласно модели жёсткого соответствия (Л.Страйер, 1984).

 

2. Модель  индуцированнного соответствия («рука – перчатка»), предложена Кошлендом в 1950-е годы. Согласно этой модели, субстрат вызывает (индуцирует) конформационные изменения фермента, и лишь в результате этих изменений аминокислотные остатки фермента принимают пространственную ориентацию, необходимую для связывания субстрата и катализа (рисунок 3.6). При этом другие аминокислотные остатки могут погрузиться вглубь молекулы фермента.

 

 

Рисунок 3.6. Взаимодействие субстрата с ферментом согласно модели индуцированного соответствия (Л.Страйер, 1984).

 

Значение конформационных изменений, возникающих в молекуле фермента в процессе присоединения к ней субстрата можно рассмотреть на примере гексокиназы. Этот фермент катализирует фосфорилирование глюкозы в реакции с АТФ. Присоединение относительно небольшой молекулы глюкозы к активному центру гексокиназы приводит к сближению полипептидных цепей двух субъединиц, которые, как клещи, захватывают молекулу глюкозы (рисунок 3.7). По-видимому, при такой индуцированной подгонке конформации фермента к структуре субстрата молекула глюкозы также деформируется и облегчается её взаимодействие с молекулой АТФ.

Рисунок 3.7. Индуцированное соответствие при взаимодействии гекокиназы с глюкозой по данным рентгеноструктурного исследования (А.Ленинджер, 1985)

 

Раздел 3.4 

Аллостерические ферменты: изменение конформации под действием эффекторов. Виды аллостерической регуляции.

 

 

Ферменты, осуществляющие в клетке различные метаболические процессы, организованы в виде последовательных цепей или систем, в которых они действуют согласованно. В каждой такой ферментной системе есть хотя бы один фермент, выполняющий роль «дирижера», который задает скорость всей последовательности реакций, так как он катализирует лимитирующую стадию, т. е. самую медленную реакцию, определяющую скорость всего процесса в целом. Такие ферменты-«дирижеры» обладают способностью повышать или понижать свою каталитическую активность в ответ на определенные сигналы.

 

Благодаря действию подобных ферментов скорость каждой последовательности метаболических реакций постоянно изменяется, почти мгновенно приспосабливаясь к изменяющимся потребностям клетки в энергии и играющих роль строительных блоков молекулах, необходимых для роста и обновления клеток. В большинстве случаев фермент-«дирижер» катализирует первую реакцию такой последовательности. Остальные же ферменты просто подчиняются указаниям «дирижера»; катализируемые ими реакции ускоряются лишь при поступлении достаточного количества субстратов, образующихся в качестве продуктов предшествующих реакций.

 

Такие ферменты-«дирижёры», активность которых изменяется под действием молекулярных сигналов различных типов, называются регуляторными. Существуют два основных класса регуляторных ферментов: аллостерические, т.е. ферменты, регулируемые нековалентно связанными с ними модуляторами, и ферменты, регулируемые путём их ковалентной модификации.

 

Многие ферменты, обладающие олигомерной структурой (хотя и не все), являются аллостерическими белками, способными изменять своё сродство к субстрату. Аллостерические ферменты, как правило, катализируют начальные реакции в многостадийных путях химических превращений в клетке. Аллостерические ферменты отличаются от остальных ферментов тем, что не подчиняются классической кинетике Михаэлиса – Ментен. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата у таких ферментов имеет вид S-образной кривой. Наряду с активным центром такие ферменты содержат по меньшей мере один аллостерический центр (регуляторный центр).

 

Аллостерический центр - участок молекулы фермента, способный присоединять определённые молекулы (эффекторы или модуляторы). Аллостерический центр специфичен по отношению к своему эффектору подобно тому, как активный центр специфичен по отношению к своему субстрату. Между аллостерическим центром одной из субъединиц фермента и аллостерическим эффектором могут возникать нековалентные взаимодействия (водородные, ионные и гидрофобные). Это приводит к обратимому изменению конформации остальных субъединиц молекулы фермента, в том числе изменению конформации активного центра. В результате активность фермента снижается или повышается.

 

 

 

 

Рисунок 3.8. Схема взаимодействия аллостерического фермента и его эффектора. Аллостерический фермент состоит из двух субъединиц: А - каталитической, включающей активный центр, и Б - регуляторной, в состав которой входит аллостерический центр. Присоединение эффектора к аллостерическому центру приводит к изменению конформации активного центра.

 

Аллостерические эффекторы бывают двух типов – активаторы и ингибиторы. Аллостерические активаторы способствуют переходу фермента из Т-конформации с низким сродством к субстрату в R-конформацию с высоким сродством к субстрату, аллостерические ингибиторы – наоборот. Если после присоединения эффектора сродство активного центра фермента к субстрату повышается, то эффектор называется аллостерическим активатором, если сродство понижается, то эффектор называется аллостерическим ингибитором.

 

Различают гомотропную и гетеротропную аллостерическую регуляцию. В случае гомотропной регуляции эффектором является субстрат. У таких ферментов аллостерический центр по своей конформации совпадает с активным, а роль аллостерического эффектора фермента выполняет молекула субстрата. Взаимодействие субстрата с активным центром одной из субъединиц аллостерического фермента повышает сродство остальных субъединиц к субстрату. Это напоминает связывание молекулы гемоглобина с кислородом.

 

В случае гетеротропной регуляции эффектор отличается от субстрата и аллостерический центр не совпадает с активным центром. Примером может служить регуляция биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов.

 

 

Рисунок 3.9. Схема биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов.

 

Начальную реакцию этого метаболического пути катализирует фермент аспартат-карбамоилтрансфераза (АКТ-аза). Конечный продукт цепи реакций – цитидинтрифосфат (ЦТФ) является аллостерическим ингибитором АКТ-азы. При увеличении концентрации ЦТФ сродство фермента к субстратам снижается, хотя максимальная скорость реакции (Vmax) остаётся неизменной. График зависимости активности от концентрации при этом смещается вправо. В этом случае Vmax может быть достигнута при более высокой концентрации субстрата (аспартата). Ингибирующее действие ЦТФ может быть снято добавлением АТФ (субстратом промежуточных реакций биосинтеза).

 

 

Рисунок 3.10. Регуляция аспартат-карбамоилтрансферазы ЦТФ и АТФ.

 

Таким образом, при накоплении ЦТФ в клетке скорость синтеза пиримидиновых нуклеотидов снижается и повышается при снижении концентрации ЦТФ. Так фермент обеспечивает постоянное присутствие в клетке нужных количеств цитидинтрифосфата..

Раздел 3.5 

Ковалентная модификация ферментов.

 

 

В ряде случаев каталитическая активность ферментов может изменяться в результате разрыва или образования ковалентных связей в молекуле. Существует несколько вариантов ковалентной модификации, из которых наибольший интерес представляют частичный протеолиз и регуляция путём фосфорилирования — дефосфорилирования.

 

Частичный протеолиз. Многие белки синтезируются в форме неактивных предшественников, которые затем активируются в результате специфического расщепления одной или нескольких пептидных связей. Если каталитически активный белок называется ферментом (или энзимом), то неактивный предшественник фермента называется проферментом (или зимогеном).

 

Активация белков путем частичного протеолиза - процесс, широко распространенный в биологических системах. Вот несколько примеров.

пищеварительные ферменты, гидролизующие белки, синтезируются в желудке и поджелудочной железе в виде проферментов: пепсин – в виде пепсиногена, трипсин – в виде трипсиногена и т.д.

свертывание крови представляет собой каскад реакций протеолитической активации проферментов. Это обеспечивает быструю ответную реакцию на повреждение кровеносного сосуда.

некоторые белковые гормоны синтезируются в виде неактивных предшественников. Например, инсулин образуется из проинсулина.

фибриллярный белок соединительной ткани коллаген также образуется из предшественника — проколлагена.