Энзимология как учение о ферментах. Простые и сложные ферменты

 

В то же время ферменты, ускоряющие перенос аминокислотных остатков на растущий конец полипептидной цепи и катализирующие некоторые другие реакции в процессе биосинтеза белка, сосредоточены в рибосомальном аппарате клетки.

 

В клеточном ядре локализованы в основном нуклеотидилтрансферазы, ускоряющие реакцию переноса нуклеотидных остатков при новообразовании нуклеиновых кислот.

 

Распределение ферментов по субклеточным органеллам изучают после предварительного фракционирования клеточных гомогенатов путем высокоскоростного центрифугирования, определяя содержание ферментов в каждой фракции.

 

Локализацию данного фермента в ткани или клетке часто удается установить in situ гистохимическими методами («гистоэнзимология»). Для этого тонкие (от 2 до 10 мкм) срезы замороженной ткани обрабатывают раствором субстрата, к которому специфичен данный фермент. В тех местах, где находится фермент, образуется продукт катализируемой этим ферментом реакции. Если продукт окрашен и нерастворим, он остается на месте образования и позволяет локализовать фермент. Гистоэнзимология дает наглядную и в известной мере физиологичную картину распределения ферментов.

 

Ферментные системы ферментов, сосредоточенные во внутриклеточных структурах, тонко координированы друг с другом. Взаимосвязь катализируемых ими реакций обеспечивает жизнедеятельность клеток, органов, тканей и организма в целом.

 

При исследовании активности различных ферментов в тканях здорового организма можно получить картину их распространения. Оказывается, что некоторые ферменты широко распространены во многих тканях, но в разных концентрациях, а другие очень активны в экстрактах, полученных из одной или нескольких тканей, и практически отсутствуют в остальных тканях организма.

 

 

Рисунок 4.2. Относительная активность некоторых ферментов в тканях человека, выраженная в процентах от активности в ткани с максимальной концентрацией данного фермента (Мосс, Баттерворт, 1978).

Изоферменты (изозимы)

 

Изоферментами или изозимами называют множественные формы ферментов, которые существуют у одного и того же вида, в одной и той же ткани, и даже в одной и той же клетке. Все эти формы фермента катализируют одну и ту же реакцию, но различаются по своим кинетическим свойствам, а также по первичной структуре. Изоферменты играют регуляторную роль в обмене веществ и позволяют метаболизму в разных тканях лучше приспосабливаться к действию внутренних и внешних факторов.

 

Примером фермента, у которого были обнаружены такие формы, может служить лактатдегидрогеназа (L-лактат:НАД+-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27), катализирующая обратимую окислительно-восстановительную реакцию:

 

 

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) присутствует в тканях животных в виде пяти разных изоферментов, которые различаются на уровне четвертичной структуры. Молекула ЛДГ состоит из четырех протомеров двух типов, Н (от англ. heart - сердце) и М (от англ. muscle - мышца), которые различаются по аминокислотному составу и последовательности аминокислот. Каталитической активностью обладает только тетрамерная молекула.

 

Протомеры могут быть скомпонованы следующими способами:

Изофермент 

HHHH 

HHHM 

HHMM 

HMMM 

MMMM

 

Обозначение 

ЛДГ1 

ЛДГ2 

ЛДГ3 

ЛДГ4 

ЛДГ5

 

 

Изоферменты сывороточной лактатдегидрогеназы могут быть обнаружены с помощью электрофореза при рН 8,6. При данном значении рН изозимы несут разный заряд и распределяются на электрофореграмме в пяти разных местах. Наибольшим отрицательным зарядом обладает изозим ЛДГ1.

 

Распределение изоферментов ЛДГ (изоферментный спектр) в тканях также отличается. Так, изоформа ЛДГ, содержащая четыре М-субъединицы, преобладает в печени и скелетной мышце, а изоформа, состоящая из четырех Н-субъединиц, преобладает в миокарде (рисунок 4.3).

 

 

Рисунок 4.3. Относительное содержание изоферментов ЛДГ (в процентах от суммарной активности) в некоторых тканях человека (Мосс, Баттерворт, 1978).

Мультиферменты

 

Мультиферменты (мультэнзимы) - надмолекулярные комплексы, в состав которых входят ферменты, катализирующие последовательные стадии превращения субстрата.

 

Например, для в реакциях превращения метаболита A в метаболит D :

 

 

комплекс ферментов Е1, Е2, Е3 является мультиферментом. Объединение нескольких ферментов в один комплекс имеет важное преимущество: резко сокращаются расстояния, на которые молекулы промежуточных продуктов должны перемещаться от фермента к ферменту. Поэтому суммарная скорость таких метаболических путей довольно высока.

 

Примером мультэнзима может служить пируватдегидрогеназный комплекс, находящийся в митохондриях и катализирует последовательные реакции окислительного декарбоксилирования пирувата:

 

 

Пируватдегидрогеназный комплекс состоит из трёх ферментов: пируватдекарбоксилазы, трансацилазы и дигидролипоилдегидрогеназы.

 

 

В промежуточных реакциях участвует пять коферментов:

тиаминдифосфат;

липоевая кислота;

коэнзим А;

ФАД;

НАД.

 

Регуляторным ферментом комплекса является пируватдекарбоксилаза, активность которой (и всего комплекса в целом) снижается при высокой концентрации АТФ в клетке.

 

Раздел 4.2 

Основные методы фракционирования белков, основанные на их различиях по физико-химическим свойствам и биологической активности.

 

 

Вся информация об отдельных метаболических реакциях, о промежуточных соединениях, образующихся на последовательных этапах различных метаболических путей, а также о механизме регуляции работы катализаторов получена главным образом с использованием очищенных препаратов ферментов. Высокоочищенные препараты ферментов необходимо иметь также и для того, чтобы получить надежные данные о кинетике, кофакторах, активных центрах, о структуре и механизме действия ферментов.

 

Процесс очистки состоит в выделении данного фермента из грубого клеточного экстракта, содержащего множество других компонентов. Основная проблема — отделить нужный фермент от сотен химически и физически сходных белков.

 

Как вам уже известно, различные белки отличаются друг от друга по своим физико-химическим свойствам и биологической активности. На этих различиях основаны широко используемые в медицине и биотехнологии методы разделения белковых смесей на фракции и выделения отдельных белков.

Методы разделения белков по молекулярной массе 

Рисунок 4.5. Разделение пептидов методом гель-фильтрации

 

 

С этой целью наиболее часто применяют методы гель-фильтрации, ультрацентрифугирования, диализа и диск-электрофореза.

 

Гель-фильтрация – метод, основанный на различной способности молекул разных размеров проходить через своеобразные «молекулярные сита» – сефадексы – инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Крупные белковые молекулы не способны диффундировать внутрь гранул сефадекса и элюируются (выходят из колонки) в первую очередь. В то же время молекулы небольшого размера проникают через поры гранул, задерживаются в них и движутся в колонке с более низкой скоростью (рисунок 4.5). Метод гель-фильтрации эффективно используется и при очистке белков от низкомолекулярных примесей.

 

Ультрацентрифугирование. Метод основывается на измерении скорости седиментации (осаждения) белковых частиц под действием центробежной силы, создаваемой в ультрацентрифуге. Скорость седиментации частиц пропорциональна их молекулярной массе.

 

Диализ – процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ при помощи полупроницаемой мембраны. Белки не способны проходить через такую мембрану, поэтому данный метод применяется для очистки белков от неорганических соединений.

 

Диск-электрофорез в полиакриламидном геле проводят в присутствии детергента – додецилсульфата натрия (ДСН), маскирующего заряд ионогенных групп в молекуле белка. Поэтому электрофоретическая подвижность белков, связанных с ДСН, будет пропорциональна их молекулярной массе.

Методы разделения белков по электрическому заряду

 

Рисунок 4.6. Разделение пептидов методом ионообменной хроматографии

 

 

На различии белков по электрическому заряду основаны методы высаливания, ионообменной хроматографии, электрофореза, изоэлектрического фокусирования.

 

Высаливание – процесс осаждения белков из раствора при добавлении сульфата аммония, а также солей щелочных и щелочноземельных металлов. Чем больше величина заряда белка, тем более высокая концентрация соли требуется для его осаждения.

 

Ионообменная хроматография – метод, основанный на взаимодействии заряженных групп белка с ионными группами полимеров-ионообменников. При разделении смеси белков на анионите (например, диэтиламиноэтилцеллюлозе) в первую очередь элюируются положительно заряженные белки, затем – нейтральные и, наконец, отрицательно заряженные белки (рисунок 4.6). При разделении смеси белков на катионообменнике (например, карбоксиметилцеллюлозе) элюция происходит в обратном порядке.

 

Электрофорез – метод, основанный на различной скорости движения белков в электрическом поле на различных носителях (бумага, полиакриламидный и крахмальный гели и т.д.). Эта скорость зависит от величины заряда белка при данном значении рН.

 

Изоэлектрическое фокусирование – методика проведения электрофореза на колонке или в тонком слое с градиентом рН, создаваемом при помощи синтетических полиаминокарбоновых кислот – амфолинов. Каждый белок разделяемой смеси будет располагаться на колонке в участке со значением рН, соответствующем его изоэлектрической точке (см. 1.4.2).

Рисунок 4.7. Разделение пептидов методом гидрофобной хроматографии

 

Методы разделения белков по гидрофобным свойствам

 

Различная гидрофобность белковых молекул используется при проведении гидрофобной хроматографии. В качестве носителя в данном случае применяется силикагель с ковалентно присоединёнными углеводородными радикалами, содержащими 8 или 18 углеродных атомов. Связывание белков с такими носителями обусловлено гидрофобными взаимодействиями между алкильными цепями и гидрофобными участками белковой молекулы. Чем выше гидрофобность белковой молекулы, тем прочнее она связывается с частицами модифицированного силикагеля. Белки наносят в составе растворов с высоким содержанием соли, например (NH4)2SO4, и элюируют раствором с понижающейся концентрацией этой же соли. При элюции вначале выделяются наиболее гидрофильные белки, а в последнюю очередь – наиболее гидрофобные (рисунок 4.7).

Методы разделения белков по биологической активности

 

Способность белков избирательно взаимодействовать с определёнными лигандами составляет основу метода аффинной или биоспецифической хроматографии.

 

Рисунок 4.8. Разделение пептидов методом аффинной хроматографии

 

 

Достоинством этого метода очистки является то, что он позволяет избирательно извлекать из сложной смеси белков один конкретный белок или по крайней мере небольшое их число. Метод основан на использовании иммобилизованного лиганда, который специфически взаимодействует с тем белком, который требуется получить в очищенном виде. Из всех белков, присутствующих в смеси, с этим иммобилизованным лигандом связываются только те белки, которые способны вступать с ним в сильное взаимодействие. После удаления всех прочих несвязавшихся белков нужный фермент элюируют с иммобилизованного лиганда либо концентрированными солевыми растворами, либо раствором, содержащим растворимую форму лиганда (рисунок 4.8). Применение метода аффинной хроматографии позволяет добиться в ходе очистки результатов, обычно превосходящих результаты последовательного применения многочисленных классических методов.

 

Как известно, ферменты обладают высокой специфичностью по отношению к своим субстратам и коферментам, поэтому наиболее подходящими лигандами служат производные субстратов и коферментов, ковалентно связанные с носителем, например с сефадексом. Они могут быть присоединены к носителю либо непосредственно, либо через связующую «ножку» (линкер) из 3—8 атомов углерода.

 

Примером успешного применения аффинной хроматографии может служить очистка множества различных дегидрогеназ на аффинных носителях с НАД+ в качестве лиганда. При этом с лигандом могут связываться несколько дегидрогеназ, которые при элюировании их раствором НАД+ выходят вместе, и их дальнейшее разделение проводят, используя уже не коферментные, а субстратные аффинные носители.

 

С аффинной хроматографией во многом сходна хроматография, при которой в качестве лигандов используются красители (голубая, зеленая или красная сефароза), а также хроматография на гидрофобных лигандах, где носителем является октил- или фенилсефароза. В первом случае в качестве иммобилизованного лиганда используют органический краситель, являющийся аналогом субстрата, кофермента или аллостерического эффектора. Элюирование обычно осуществляют солевым раствором увеличивающейся концентрации.

 

Раздел 4.3 

Принципы и методы определения активности ферментов в биологическом материале.

 

 

Ферменты, по сравнению с другими веществами белковой природы, обладают уникальным свойством ускорять химические реакции. Это свойство может быть использовано для количественного определения содержания ферментов в биологическом материале (тканевом экстракте, сыворотке крови и т.д.). При правильно подобранных экспериментальных условиях почти всегда существует пропорциональность между количеством фермента и скоростью катализируемой реакции, поэтому по активности фермента можно судить о количественном содержании его в исследуемой пробе.