Кинетика ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ  РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

 «МОГИЛЕВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ А. А. КУЛЕШОВА»

 

 

 

 

ФАКУЛЬТЕТ ЕСТЕСТВОЗНАНИЯ

КАФЕДРА ХИМИИ

 

 

 

 

 

 

Кинетика  ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой.

 

 

 

 

 

 

 

Курсовая работа

Студентки 5 курса

специальности 1-31 05 01-02

«Химия» (научно-

педагогическая деятельность)

Коржовой Марины Игоревны

 

Научный руководитель:

доцент, канд. хим. наук

Клебанов Александр  Владимирович

 

 

 

Могилев 2011

СОДЕРЖАНИЕ

 

Введение………………………………………………………………….…….3

 

1. Обзор литературы…………………………………………………………...4

 

1.1. Каталаза.……………………………..………………………….…………4

 

1.2. Механизм действия ферментов…..………………………………..….….7

 

1.3. Кинетика ферментативных реакций………………………………..…....8

 

1.4. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций……..…...11

 

 

2. Объекты исследования и методики эксперимента………………..….…..17

 

2.1. Объект исследования……………………………………………..............17

 

2.2. Методика эксперимента………………………………….……....……....17

 

    2.2.1. Определение активности фермента каталазы…………………...…17

 

    2.2.2. Принцип метода……………………………………………..…….…17

 

 

3. Экспериментальные результаты и их обсуждение…………….……..…..20

 

 

Заключение………………………………………………………………..……22

 

Список использованных источников………………………….……….……..23

 

Приложения…………………………………………………………….………24

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Ферментативный  катализ наиболее широко используется, поэтому изучение его необходимо для студентов. Ферментативный катализ  отличается исключительно высокой  эффективностью (увеличение скорости реакции в 10¹⁰ – 10¹³ раз), специфичностью и регулируемостью, т. е. изменением активности ферментов в зависимости от потребностей организма. Я исследовала фермент каталаза – это один из широко используемых ферментов. Определение активности фермента в эритроцитах человека используют в медицине для диагностики некоторых заболеваний крови.

Каталаза (от греч. Katalysis – разрушение) — фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород:

2Н₂О₂ = О₂ + 2Н₂О.

Каталаза содержится у всех животных и растений, в том числе в печени (в специальных внутриклеточных органеллах – пероксисомах), в эритроцитах млекопитающих (до 2% от сухого веса) и почти у всех аэробных микроорганизмов. Молекула каталазы из печени быка (молекулярный вес 250 тыс.) состоит из четырех идентичных субъединиц и содержит четыре иона железа. Если ионы железа удалить, то фермент полностью лишится своих каталитических свойств. Ионы железа – активные центры каталазы.

Активность  каталазы – одна из наибольших среди известных ферментов (одна молекула каталазы способна разложить за 1с 44 тыс. молекул Н₂О₂). Активность каталазы оценивают по объему выделившегося в каталитической реакции О₂ или по изменению концентрации Н₂О₂. Активность каталазы может служить индикатором состояния природной среды обитания живых организмов.

Биологическая роль каталазы заключается в защите клеточных мембран от Н₂О₂, а вместе с супероксиддисмутазой – и от супероксидного радикала. Генетически обусловленная недостаточность каталазы является одной из причин так называемой акаталазии — наследственного заболевания, клинически проявляющегося изъязвлением слизистой оболочки носа и ротовой полости, иногда резко выраженными атрофическими изменениями альвеолярных перегородок и выпадением зубов. С каталазой и пероксидазой связывают надежды на получение высокоэффективных препаратов для лечения злокачественных опухолей, так как полагают, что эти ферменты играют важную роль в росте клеток.

Цель курсовой работы – изучение кинетики ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой.

 Исходя из  этого были поставлены следующие  задачи:

1) Отработка методики перманганатометрического титрования Н₂О₂;

2) Определение зависимости активности каталазы от температуры, концентрации субстрата и времени реакции;

3) Разработать и внедрить лабораторную работу.

 

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.1. Каталаза

 

Молекулярный  кислород сам по себе обычно не вступает в неконтролируемые химические реакции  внутри организма, для его активации  нужны ферментативные процессы –  главные ферменты метаболизма кислорода у млекопитающих: оксидазы и оксигеназы. Но в каталитических центрах этих ферментов кислород испытывает превращения до конечных соединений, не выделяясь в среду и не подвергая опасности органические макромолекулы клетки, повреждающими же агентами являются активные формы кислорода, образующиеся в ряде физико-химических процессов в организме. Их образование активируется при различных стрессовых ситуациях, особенно при токсическом воздействии. Главные активные формы кислорода:

• супероксидные радикалы (О₂^-),
• перекись водорода (Н₂О₂),
• гидроксильные (свободные) радикалы (* ОН, НО₂*),
• синглетные формы кислорода (¹О₂),
• ионы НО₂-.

Основные механизмы  появления активных форм кислорода  в организме связаны обычно с  нарушениями функционирования электронотранспортных цепей митохондрий или микросом, а также при изменении свойств дегидрогеназ. Особняком стоит нормальный процесс формирования активных форм кислорода фагоцитами в ходе стимуляции неспецифической защиты организма.

Гидроперекиси липидов являются весьма активными соединениями и обладают высокой биологической агрессивностью. Для протекания цепного окисления липидов в биологических мембранах совершенно необходимы переходные металлы, в частности, ионы железа. Простым и доступным методом определения продуктов перекисного окисления липидов является реакция с тиобарбитуровой кислотой.

В процессе эволюции в клетках для защиты от активных форм кислорода выработались специализированные системы: ферментативная антиоксидантная  система и неферментативная антиоксидантная система. В качестве неферментативной антиоксидантной системы могут выступать: жирорастворимые антиоксиданты (витамин Е, в-каротин, убихиноны), водорастворимые (аскорбат, рутин, глутатион). Гидрофобные антиоксиданты локализованы в биомембраннах, гидрофильные – в цитозоле клетки.

Ферментативная  антиоксидантная система включает: супероксиддисмутазу, катализирующую реакцию дисмутации О₂^- в Н₂О₂, каталазу, разлагающую Н₂О₂, глутатионпероксидазу, глутатион-S-трансферазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глутатионредуктазу. Глутатионзависимые ферменты удаляют органические перекиси.

Супероксиддисмутаза играет важную роль в защите клеток от действия супероксид-анион радикала, стабилизирует клеточные мембраны, предотвращая процессы перикисного окисления липидов. Активность супероксиддисмутазы обычно достаточна, чтобы инактивировать активные формы кислорода в месте их образования, не допуская диффузии в среде макромолекул ткани.

Дисмутация  супероксидных анион-радикалов под  действием супероксиддисмутазы в биологических тканях ведет к образованию перекиси водорода, способной легко проникать через мембраны клеток. Перекись водорода обнаруживается при фагоцитозе, при работе митохондрий и микросом. В присутствии ионов переходных металлов (например Fe²⁺) Н₂О₂ может давать высоко активный гидроксильный радикал (* ОН). Этому процессу препятствуют главные высоко активные ферменты антиоксидантной защиты организма: каталаза и глутатион-пероксидаза.

Измерение перекиси водорода в биосубстратах проводят обычно методом титрования перманганатом калия, реакцией с молибдатом аммония или прямой спектрофотометрией при длине волны равной 240 нм. Используют также пероксидазную реакцию, в ходе которой изменяется окраска индикатора, например, индигокармина, и флюориметричсекие методы.

Каталаза – один из основных ферментов разрушения активных форм кислорода и является основным первичным антиоксидантом системы защиты, который катализирует разложение токсичной перекиси водорода до молекулярного кислорода и воды:

2H₂O₂ = 2H₂O + O₂.

Разложение Н₂О₂ каталазой осуществляется в два этапа:

CAT + Н₂О₂ → CAT-Н₂О₂

CAT-Н₂О₂ + Н₂О₂ → CAT + 2Н₂О + О₂

Когда концентрация перекиси водорода становится незначительной, каталаза начинает катализировать реакцию  окисления перекисью водорода спиртов, формальдегидов и нитратов.

Открытие каталазы связано с перекисью водорода. Еще Луи Тенар, который занимался  каталитическим разложением аммиака, открыл перекись водорода в 1818 году и  заметил каталитическую активность по отношению к этому веществу животных тканей. Но только в 1907 году было установлено, что в этом повинен фермент, который и назвали каталазой. В кристаллическом виде получить ее удалось только через 30 лет из печени быка. Это один из наиболее активных ферментов, молекула которого разлагает в секунду 6 миллионов молекул перекиси водорода.

Каталаза широко распространена в тканях животных, в т.ч. человека, растений и в микроорганизмах (однако фермент полностью отсутствует  у некоторых анаэробных микроорганизмов). В клетках каталаза в основном сосредоточена в пероксисомах, в которых содержатся и ферменты, продуцирующие перекись водорода, необходимую в ходе ряда процессов жизнедеятельности организма, в частности, в процессах неспецифической иммунной защиты. Частично каталаза имеется в микросомах и в меньшей мере – в цитозоле. Максимальная концентрация каталазы обнаружена в эритроцитах.

Каталаза – это тетрамерный гем, содержащий белок, который образуется в цитозоле в виде мономеров, не содержащих гем. Мономеры переносятся в просвет пероксисом и там собираются в тетрамеры в присутствии гема. Хотя каталаза не содержит сигнальной последовательности, отрезаемой после использования, она должна иметь какой-то сигнал, направляющий ее в пероксисому. Согласно последним данным, эту роль, по крайней мере, частично играет специфическая последовательность из трех аминокислот, расположенная вблизи карбоксильного конца многих пероксисомных белков.

Каталаза – фермент класса оксиредуктаз. Она представляет собой гемопротеин, простетической группой которого является гем, содержащий ион трехвалентного железа. Молекула каталазы состоит из четырех, по-видимому, идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 000 и имеет соответственно четыре простетические группы. Феррипротопорфириновые группы гема прочно связаны с белковой частью фермента — апоферментом и не отделяются от него при диализе.

Оптимальная величина рН для каталазы находится в интервале  значений 6,0—8,0.

Спектр поглощения нативного фермента имеет 2 главных  пика – 269 нм и 391 нм, что характерно для гемопротеинов.

Каталаза ингибируется азидом, цианидом, пероксидом водорода в высоких концентрациях и некоторыми органическими гидроперекисями. Каталаза может выступать источником образования АФК. 0,5% кислорода, образующегося в результате разложений перекиси водорода, возникает в возбужденном синглетном состоянии.

Методы определения  активности каталазы основаны на регистрации  образующегося в процессе реакции  О₂ (манометрическим или полярографическим методами) или на измерении текущей (спектрофотометрическим) или остаточной (перманганатометрическим, йодометрическим и другими титриметрическими методами) концентрации перекиси водорода.

Биологическая роль каталазы заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в  клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода.

Многие люди испытывают недостаточность этого  фермента, что связано с недостатком  железа и меди в крови.

Активность  каталазы в эритроцитах остается постоянной при ряде заболеваний, однако при злокачественной и других макроцитарных анемиях увеличивается, так называемый, каталазный индекс (отношение величины каталазной активности определенного объема крови к количеству эритроцитов в этом объеме), имеющий существенное диагностическое значение. При злокачественных новообразованиях отмечается уменьшение активности каталазы в печени и почках, причем существует зависимость между величиной опухоли, скоростью ее роста и степенью уменьшения активности каталазы.

 

 

 

 

1.2. Механизм действия ферментов

 

 

До установления химической природы ферментов гипотезы о механизме действия ферментов  опирались на исследования кинетики и на модельные опыты химического  гомогенного катализа. Повышение скорости химических реакций под действием ферментов объясняли: