Кинетика ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой

H₂O₂ – 2eˉ= O₂ + 2H⁺

 

2.2.2. Принцип метода

 

Предлагаемый  метод определения активности каталазы основан на учете количества разложившейся перекиси под действием раствора фермента методом перманганатометрического титрования.

 

 

 

Приготовление раствора каталазы

 

На аналитических  весах взвешиваем навеску фермента (10 – 16 мг), вносим в мерную колбу на 1 л, растворяем в бидистиллированной воде и доводим до метки. Неиспользуемый раствор фермента храним в холодильнике при температуре примерно +5 в течение 7 дней.

 

 

Измерение активности фермента от температуры

 

В колбу для  титрования мерным цилиндром вносим 20 мл дистиллированной H₂O, пипеткой 10 мл раствора H₂O₂ (0.15 н) и оставляем стоять при заданной температуре (0, 15, 20, 25, 30, 40^оС), вносим в колбу 5 мл раствора фермента и оставляем стоять при заданной температуре на 20 минут. Прекращаем действие фермента 10 мл 10%-ого раствора H₂SO₄ и оттитровываем 0.2 н раствором KMnO₄ (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечаем объем раствора KMnO₄, пошедшего на титрование оставшегося раствора H₂O₂.

Параллельно проводим холостой опыт. В колбу для титрования мерным цилиндром вносим 20 мл дистиллированной H₂O и пипеткой 10 мл раствора H₂O₂ и оставляем стоять при температуре исследования на 20 минут, далее заливаем исследуемый раствор 10%-ым раствором H₂SO₄ и оттитровываем 0.2 н раствором KMnO₄ (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечаем объем раствора KMnO₄, пошедшего на титрование оставшегося раствора H₂O₂. По разности между опытным и контрольным титрованием находим количество перманганата, эквивалентное количеству разложенной ферментом H₂O₂.

 

Измерение активности фермента от концентрации субстрата

 

В колбу для  титрования мерным цилиндром вносим 20 мл дистиллированной H₂O, пипеткой 10 мл раствора H₂O₂ определенной концентрации (0,014, 0,029, 0,069, 0,142, 0,293, 0,396, 0,566, 0,906 н) и оставляем стоять при 25^оС несколько минут для достижения смесью температуры исследования. Далее по секундомеру в колбу вносим 5 мл раствора фермента и оставляем стоять при 25^оС. Через 20 минут прекращаем действие фермента добавлением 10 мл 10%-ого раствора H₂SO₄ и оттитровываем 0.2 н раствором KMnO₄ (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечаем объем раствора KMnO₄, пошедшего на титрование оставшегося раствора H₂O₂.

Параллельно проводим холостой опыт. В колбу для титрования мерным цилиндром вносим 20 мл дистиллированной H₂O и пипеткой 10 мл раствора H₂O₂ определенной концентрации (0,014, 0,029, 0,069, 0,142, 0,293, 0,396, 0,566, 0,906 н) и оставляем стоять 20 минут при 25^оС. Далее заливаем исследуемый раствор 10%-ым раствором H₂SO₄ и оттитровываем 0.2 н раствором KMnO₄ (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечаем объем раствора KMnO₄, пошедшего на титрование оставшегося раствора H₂O₂. По разности между опытным и контрольным титрованием находим количество перманганата, эквивалентное количеству разложенной ферментом H₂O₂.

 

Измерение активности фермента от времени

 

В стакан на 300 мл вносим 100 мл дистиллированной H₂O, 50 мл раствора H₂O₂ (0,137 н) и оставляем стоять при 25^оС несколько минут для достижения смесью температуры исследования. Далее по секундомеру в колбу вносим 25 мл раствора фермента и оставляем стоять при 25^оС. Через 3, 5, 7, 16, 30, 45, 60, 90, 120 минут пипеткой отбираем 10 мл смеси из стакана и переносим в колбу для титрования. Прекращаем действие фермента добавлением 10 мл 10%-ого раствора H₂SO₄ и оттитровываем 0.2 н раствором KMnO₄ (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечаем объем раствора KMnO₄, пошедшего на титрование оставшегося раствора H₂O₂.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

 

Нами были проведены  исследования по определению активности фермента каталазы в зависимости  от температуры среды, концентрации субстрата (H₂O₂) и времени реакции.

 

1. Зависимость активности от температуры.

При увеличении температуры от 0 до 25^оС активность раствора фермента увеличивается, при дальнейшем увеличении температуры активность каталазы заметно снижается, так как происходит тепловая денатурация фермента. При 25^оС мы наблюдали наибольшую активность фермента, что соответствует данным каталога химических реактивов.

 

2) Зависимость активности от концентрации субстрата.

Видно, что с  увеличением концентрации субстрата  активность фермента увеличивается  и выходит на максимальное значение. Начальный участок графика имеет прямопропорциональную зависимость, что соответствует первому порядку реакции.

 

3) Зависимость активности от времени реакции.

Видно, что с  увеличением времени реакции активность фермента снижается.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

1. Отработана методика перманганатометрического титрования перекиси водорода;
2. Отработана методика определения активности фермента каталазы;
3. Показано влияние температуры среды, концентрации субстрата и времени реакции на активность фермента каталазы;
4. Разработана и внедрена лабораторная работа.

Оптимальная температура  для работы с раствором каталазы 25 ^оС.

Оптимальная концентрация Н₂О₂ для работы с раствором фермента не превышает 0,15 н, так как здесь еще сохраняется прямолинейная зависимость.

Удобное для  работы время действия фермента на субстрат 20 минут, в этом случае сохраняется  прямопропорциональная зависимость активности фермента от времени его действия на субстрат.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК  ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

 

1. Кудряшов А.М.,Титова Н.М.//Экология человека.–2005.–№1.–С.14–18.

2. Немцова Е.Р., Сергеева Т.В.//Росс. онкол. журнал .-2003.-№5.-С. 48-53.

3. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.  Т.1-3. -М.: Мир, 1982.- 1120 с.

4. Шахматова  О.А.// Экология моря. -2001.-№59.-С.48-50.

5. Дюга Э. Пенни К. Биоорганическая химия. - М.: Мир, 1983. -507 с.

6. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. Основы биохимии.Т.I.-М.:Мир,1981.-535 с.

7. Фершт Э.  Структура и механизм действия  ферментов.-М.:Мир,1980.-388с.

8. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека.- М.: Мир, 1993.- 382 с.

9. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. - М.: Высш. шк., 1985. -503 с.

10. Краснов К.С. Физическая химия. – М.: Высш. шк., 2001.-319 с.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПРИЛОЖЕНИЯ

 

Активность фермента от температуры.

Таблица 1

 

№	T	V1	V0	∆V	C1	C0	∆C	A
1	0	7,3	7,5	0,2	0,15	0,146	0,004	0,000013
2	20	4,0	8,1	4,1	0,15	0,074	0,076	0,00025
3	25	2,95	8,1	5.15	0,15	0,0546	0,0954	0,00031
4	30	4,25	8,1	3,85	0,15	0,0787	0,0713	0,000234
5	40	5,8	8,15	2,35	0,15	0,1067	0,0433	0,000142

 

 

Активность фермента от концентрации субстрата.

 

Таблица 2

 

	V1	V0	∆V	C1	C0	∆C	A
1	0,15	0,7	0,55	0,014	0,003	0,011	0,000036
2	0,35	1,25	0,9	0,029	0,0081	0,0209	0,000068
3	2,2	3,4	1,2	0,069	0,0446	0,0244	0,00008
4	3,5	6,5	3,0	0,142	0,0295	0,1125	0,00037
5	5,5	13,0	7,5	0,293	0,1239	0,1691	0,00055
6	8,5	17,0	8,5	0,396	0,198	0,198	0,00065
7	15,5	25,0	9,5	0,566	0,3509	0,2151	0,0007
8	30,0	40,0	10,0	0,906	0,6795	0,2265	0,00074

 

 

Активность фермента от времени.

 

Таблица 3

 

τ, мин	V1, KMnO4	C0, Н2О2	С1, Н2О2	∆C	A
3	1,2	0,137	0,0164	0,1206	0,00335
5	1,0	0,137	0,0137	0,1233	0,00205
7	0,9	0,137	0,0123	0,1247	0,00148
16	0,6	0,137	0,0082	0,1288	0,00067
30	0,3	0,137	0,0041	0,1329	0,00037
45	0,2	0,137	0,0027	0,1343	0,000248
60	0,15	0,137	0,0021	0,1349	0,000187
90	0,1	0,137	0,0014	0,1356	0,000125
120	0,1	0,137	0,0014	0,1356	0,000094