Сущность хромотографического анализа

                                             Содержание

 

Хроматографические методы анализа………………………………………………………………3

    Колончатая  хроматография……………………………………………………………………………4

    Тонкослойная  хроматография……………………………………………………………………….5

    Бумажная хроматография……………………………………………………………………………...6

    Газожидкостная хроматография(ГЖД)…………………………………………………………..7

          Газ-носитель……………………………………………………………………………………………….8

          Колонки………………………………………………………………………………………………………8

    Высокоэффективная жидкостная хроматография……………………..………………..10

    Список используемых источников……………………..………………………………………..13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                           Хроматографические методы анализа

 

Хроматографией называется метод разделения и анализа смеси веществ, основанный на   различной сорбции компонентов анализируемой смеси определенным сорбентом. Впервые хроматография была предложена в 1903 г. русским ученым М.С. Цветом. В настоящее время этот метод разделения и анализа смесей веществ применяется практически во всех областях химической технологии. Различают следующие основные типы хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную, электронообменную, электрофорез и гель-хроматографию.    

В адсорбционной хроматографии адсорбирующей поверхностью является неподвижная твердая фаза, состоящая из мелкоизмельченного пористого материала (сорбента) - силикагеля, окиси алюминия, активированного угля, магнезии и т.п. Подвижной фазой служит жидкость или газ. Разделение анализируемых веществ основано на их различной способности к миграции в пористой среде (неподвижной фазе) за счет перемещения подвижной фазы.

Для хроматографического разделения небольшое количество анализируемого образца помещают в верхнюю часть колонки, заполненной пористым сорбентом, и пропускают через колонку сверху вниз газ или жидкость. Подвижная фаза проходит сначала через анализируемый образец, а затем движется через слой сорбента. При этом компоненты анализируемой смеси многократно распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Вследствие различной адсорбции их на неподвижной фазе они мигрируют вдоль колонки с различной скоростью, разделяются и выходят из колонки отдельно. При контроле состава выходящей из колонки подвижной фазы можно зафиксировать моменты появления индивидуальных компонентов и определить их количественно.

В распределительной хроматографии распределение растворенного вещества происходит между двумя или более жидкими фазами или между неподвижной жидкой и газовой фазами. Неподвижная жидкая фаза может представлять собой пленку или слой либо быть диспергированной на объемном инертном твердом носителе.

В ионообменной хроматографии нерастворимой неподвижной твердой фазой является ионообменная смола, а подвижной фазой - раствор электролита.

В электронообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используют полимерные смолы, обладающие окислительно-восстановительными свойствами, способные избирательно окислять или восстанавливать компоненты подвижной фазы.

При электрофорезе компоненты смеси ионов на твердом носителе (например, фильтровальная бумага или колонка с сорбентом, пропитанным проводящим электрический ток буферным раствором) мигрируют с различными скоростями и разделяются на зоны под действием электрического поля. Этот метод часто используется для разделения белков (поле низкого напряжения), аминокислот и пептидов (поле высокого напряжения). В гель-хроматографии колонка заполняется адсорбентами, на поверхности которых имеются поры определенного размера (молекулярные сита). Мелкие молекулы могут проникать в поры, а крупные - нет. Поэтому мелкие молекулы более прочно удерживаются неподвижной фазой при проявлении растворителем, чем крупные, и соответственно выходят из колонки позже.

В зависимости от техники проведения хроматографического разделения различают колоночную, бумажную, тонкослойную (ТСХ), газовую, газожидкостную хроматографию (ГЖХ) и др.

Хроматографию применяют для очистки, разделения и количественного анализа веществ. Достоинствами хроматографических методов анализа являются их высокая чувствительность и селективность. Для анализа требуется небольшое количество вещества. Хроматография позволяет разделять и анализировать смеси веществ, близких по своим свойствам.

Колоночная хроматография 

Колоночная хроматография, как адсорбционная, так и распределительная, является простым и удобным методом разделения смеси веществ. Описанный выше метод адсорбционной колоночной хроматографии называется элюентным анализом. Как уже указывалось, при элюентном анализе подвижную жидкую фазу пропускают через колонку до тех пор, пока все зоны, образованные компонентами образца, не выйдут из колонки. Метод можно изменить, применяя последовательно несколько различных растворителей, подобранных таким образом, что каждый следующий является более эффективным элюирующим (вымывающим) агентом. Это позволяет ускорить процесс разделения смеси. Для удовлетворительного разделения компонентов смеси важно соблюдать ряд условий при проведении анализа. Колонка не должна быть "перегружена" анализируемым веществом, т. е. размер пробы, загружаемой в колонку данного размера, ограничен. Рекомендуется использовать 25-50 г адсорбента на 1 г адсорбирующего материала при хорошей адсорбции и 100-1000 г адсорбента, если образец обладает слабой адсорбцией. Диффузия должна быть незначительной. Для этого используют плотный слой сорбента и увеличивают скорость движения подвижной фазы. Равновесие между подвижной и неподвижной фазами должно устанавливаться быстро. Это возможно лишь при большой скорости адсорбции и десорбции с неподвижной фазы.

Успех хроматографирования на колонке зависит главным образом от правильного выбора сорбента и подвижной фазы. Полярные сорбенты (например, окись алюминия) хорошо сорбируют полярные органические вещества из неполярных растворителей. Такие полярные вещества легко вытесняются из колонки полярным растворителем. Сорбенты классифицируют по их относительной полярности и емкости (т. е. способности сорбировать определенное количество вещества). Одним из наиболее распространенных сорбентов, используемых в колоночной хроматографии, является силикагель. По величине рН водной суспензии силикагель относят к слабокислым сорбентам. Обычно используют технический силикагель, содержащий 10-20% воды, хотя максимальная активность силикагеля достигается после нагревания в течение нескольких часов при 150-160 С. На силикагеле хорошо разделяются алкалоиды, сложные эфиры Сахаров, глюкозиды, липиды, глицериды, стероиды, аминокислоты. Использование метанола и этанола в качестве подвижной фазы снижает активность силикагеля.

Окись алюминия для хроматографии бывает основная, нейтральная и кислая. Кроме того, в зависимости от содержания воды (от 0 до 15%) различают 5 степеней активности окиси алюминия. Наиболее активную (сухую) окись алюминия получают прокаливанием при 400-450 С. В колоночной хроматографии обычно используют основную (рН 9,0-10,0) и нейтральную окись алюминия. На ней хорошо разделяются спирты, углеводороды, стероиды, алкалоиды, природные пигменты, витамины и сложные эфиры. Надо иметь в виду, что окись алюминия может инициировать многие реакции (конденсации, полимеризации и др.). При использовании окиси алюминия нельзя применять в качестве элюентов ацетон и этилацетат.

Свойства магнезии (окиси магния) сходны со свойствами окиси алюминия, однако магнезия более эффективна для разделения ненасыщенных соединений. Ее часто используют для разделения витаминов, стероидов, алкалоидов, сложных эфиров.

Активированный древесный уголь пригоден для разделения углеводов, пептидов, аминокислот. Он избирательно сорбирует ароматические углеводороды.

Растворители располагают в ряд по их элюирующей способности; обычно элюирующая способность соответствует величине диэлектрической проницаемости растворителя. Можно привести следующий ряд растворителей по уменьшению их элюирующей способности: органические кислоты, пиридин, вода, метанол, этанол, пропанол, ацетон, дихлорэтан, этилацетат, хлороформ, диэтиловый эфир, бензол, четыреххлористый углерод, циклогексан, гексан. При использовании в качестве сорбента активированного угля этот ряд обращается.

В отличие от описанного ранее метода элюирование можно прекратить, как только фронт растворителя достигнет конца колонки. После этого весь столбик сорбента аккуратно выталкивают из колонки и определяют зоны расположения индивидуальных компонентов (по окраске, свечению при облучении УФ-лампой или после обработки специальным реагентом, образующим с компонентами смеси окрашенные соединения).

Отношение пути, пройденного зоной определяемого компонента, к пути, пройденному фронтом растворителя, обозначается и является важной характеристической величиной. Большое число значений Rf включено в справочники по хроматографии, их знание облегчает идентификацию компонентов исследуемого образца. К недостаткам адсорбционной колоночной хроматографии относится длительность элюирования.

В отличие от адсорбционной распределительная колоночная хроматография напоминает противоточную экстракцию. Она основана на распределении растворенных веществ между подвижной органической фазой и водной фазой, удерживаемой твердым носителем. Носитель должен быть инертен по отношению к разделяемым веществам, но должен хорошо удерживать неподвижную жидкую фазу. Обычно применяемые носители (силикагель, кизельгур, целлюлоза) удерживают 0,5-1 мг жидкой фазы на 1 г собственной массы. В качестве неподвижной жидкой фазы чаще всего используют воду. При разделении веществ, хорошо растворимых в органических растворителях, часто поступают наоборот: твердый носитель пропитывают органическим растворителем, а в качестве подвижной жидкой фазы используют воду.

Колоночной распределительной хроматографией удобно пользоваться для препаративного выделения чистых веществ. Как уже отмечалось, основным недостатком колоночной хроматографии является длительность разделения. Время хроматографирования можно уменьшить, если использовать тонкослойную или бумажную хроматографию.

Тонкослойная хроматография

Для проведения тонкослойной хроматографии используют стеклянные пластинки, покрытые тонким (до 1 мм) слоем мелкозернистого сорбента. Слой сорбента может быть закрепленным или незакрепленным.

Для проведения анализа каплю раствора анализируемой смеси наносят на слой сорбента недалеко от конца пластинки. Затем этот конец стеклянной пластинки опускают в хроматографическую камеру с растворителем (пластинку располагают наклонно под углом 20-30). Под влиянием капиллярных сил растворитель движется вдоль пластинки, а компоненты анализируемой смеси движутся вместе с растворителем, но с различной скоростью, разделяясь на отдельные зоны (хроматографические пятна). После того как фронт растворителя пройдет расстояние, несколько меньшее длины пластинки, ее вынимают из растворителя, подсушивают, определяют положение хроматографических пятен (визуально, при УФ-освещении или после проявления подходящим реагентом) и рассчитывают величины Rf для отдельных компонентов смеси. Данные величины Rf сравнивают с величинами, полученными в опыте с чистым компонентом. Для установления химической природы и количества компонентов разделенные зоны соскабливают с пластинки, вещество вымывают из сорбента подходящим растворителем и после фильтрации анализируют соответствующими микроаналитическими методами (чаще всего спектральными). Выбор сорбента и растворителя производят так же, как и при колоночной хроматографии. Аналогично проводят и распределительную тонкослойную хроматографию смесей.

В нашей стране серийно выпускается комплект "Аппаратура для тонкослойной хроматографии", в который входят: стол для закрепления пластин, шаблон для нанесения закрепленного слоя сорбента толщиной от 0,1 до 3 мм, подставка и валики для нанесения незакрепленного слоя сорбента толщиной от 0,2 до 1 мм, набор хроматографических камер, пульверизатор, камера для опрыскивания пластинок, шаблон для нанесения вещества, прибор для снятия слоя сорбента с веществом, УФ-осветители и другая необходимая аппаратура.

Для получения закрепленного слоя сорбент фиксируют на стекле. В качестве фиксаторов применяют гипс медицинский, аэросил-380, рисовый и маисовый крахмал. Для приготовления хроматографических пластин устанавливают по уровню стол для закрепления пластин, закрепляют в нем необходимое количество вымытых и высушенных стеклянных пластин и с помощью шаблона наносят на пластины слой массы, состоящей из сорбента, связующего вещества и воды. После подсыхания слоя в течение 10-15 мин пластины переносят в кассеты и досушивают в горизонтальном положении при комнатной температуре. Для приготовления пластины с незакрепленным слоем ее кладут на специальную подставку, насыпают на пластину сорбент и, раскатывая его валиком с уступом выбранной величины, получают равномерный слой сорбента необходимой толщины. Пробу вещества наносят из микропипетки через отверстия в специальном шаблоне. Хроматографирование проводят в специальной камере. При отсутствии камеры можно воспользоваться чашкой Петри и эксикатором или любой плоской кюветой и стеклянным колпаком необходимых размеров.

Для обнаружения на хроматограмме бесцветных веществ обычно пользуются осветителями (ультрахемископами) с УФ-излучением, соответствующим длине волны 254 или 365 нм. Наиболее распространенный химический метод обнаружения хроматографических пятен заключается в опрыскивании пластины из пульверизатора реагентом, дающим цветные реакции с исследуемыми веществами. В качестве "проявителя" часто используется I2 в виде 1% раствора в метаноле или камеры с парами I2 (йодная камера). Соединения проявляются в виде коричневых пятен. Можно использовать также 50-98% серную кислоту. После опрыскивания ею пластинки нагревают до 100-150 С. При этом соединения проявляются в виде черных пятен. Углеводы обнаруживают с помощью анисового альдегида. Для этого берут 0,5 мл анисового альдегида в 0,5 мл концентрированной серной кислоты, добавляют 9 мл С2Н5ОН и несколько капель СН3СООН. После опрыскивания пластину нагревают при 100°С в течение 20-30 мин: наблюдаются пятна голубого цвета различных оттенков.

Алкалоиды и органические основания проявляются реагентом Драгендорфа в виде оранжевых пятен, аминокислоты - нингидрином, стероиды, витамины, липиды - SbCl3 и т. д.