Сущность хромотографического анализа

В настоящее время промышленностью многих стран выпускаются готовые к применению пластины из фольги или других материалов с тонким закрепленным слоем сорбента. В СССР наиболее распространены пластины типа силуфол (на фольге) производства ЧССР. В качестве сорбента можно использовать целлюлозу в виде полосок специальной бумаги. Бумажная хроматография нашла широкое применение в практике исследовательских и аналитических работ.

Бумажная хроматография

Для разделения компонентов смеси методом бумажной хроматографии на полоску фильтровальной хроматографической бумаги в 2-4 см от конца ее помещают каплю анализируемого образца, а конец полоски опускают в растворитель, который начинает двигаться по бумаге под действием капиллярных сил. Для предотвращения дегидратации бумаги подвижную фазу обычно насыщают водой. При движении подвижной фазы компоненты исследуемого образца, нанесенного на бумагу вблизи старта, распределяются между движущимися растворителем и пленкой воды, удерживаемой целлюлозой. При этом компоненты движутся с разной скоростью в виде зон, размер которых обычно несколько больше размера начального пятна. Хроматографию на бумаге обычно проводят в закрытом сосуде (рис. 1), чтобы избежать испарения растворителя при хроматографировании. При восходящей хроматографии верхний конец полоски бумаги закрепляют в держателе, а нижний опускают в растворитель, который налит в низкую кювету или чашку Петри, расположенную на дне сосуда, в котором проводится хроматографирование. Для этих целей можно использовать также большой мерный цилиндр, на дно которого наливают подвижную фазу, а сверху закрывают стеклом. При нисходящей хроматографии растворитель движется вниз по бумаге из расположенного в верхней части сосуда резервуара с растворителем. Таким способом можно элюировать отдельные компоненты. Проявление бумажных хроматограмм в принципе не отличается от описанного для тонкослойных. Эффективность бумажной хроматографии зависит как от типа бумаги, так и от состава подвижной фазы. Сорта бумаги отличаются пористостью, толщиной, степенью гидратации. По скорости движения растворители различают быстрые, средние и медленные бумаги. Наиболее распространенные типы хроматографических бумаг - ленинградская, ватман и др. Наиболее распространенные системы растворителей: СН3СООН-Н2O (15:85 объем), 1-бутанол - СН3СООН-Н20 (4:1:5), 2-пропанол - NH3 (конц.) - Н2O (9:1:2), 1-бутанол - 1,5 н. NH3 (1:1), фенол - вода и др. Состав подвижной фазы обычно подбирают экспериментально или ориентируясь на данные, приведенные в справочниках или монографиях по бумажной хроматографии. Использование ионообменной бумаги позволяет сочетать достоинства бумажной хроматографии и ионного обмена. Такую бумагу получают путем смешения ионообменной смолы с целлюлозой, используемой для изготовления бумаги. Бумажная хроматография имеет большое значение для качественного анализа. Использование ее в количественном анализе ограниченно.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

Газожидкостная хроматография основана на физико-химическом разделении анализируемых компонентов, находящихся в газовой фазе, при их прохождении вдоль нелетучей жидкости, нанесенной на твердый сорбент. Это один из наиболее перспективных методов анализа. Широкое распространение и перспективность методов ГЖХ обусловлены тем, что они позволяют разделить и количественно определить вещества в сложной смеси даже в тех случаях, когда они сходны по химическим свойствам, а температуры кипения W различаются на десятые доли градуса. Для анализа требуются очень малые количества вещества, а время определения обычно исчисляется минутами.

Разделение анализируемых веществ происходит в колонках (трубках), наполненных твердым пористым сорбентом, на который нанесена жидкая нелетучая стационарная фаза. Пары анализируемых веществ, смешанные с газом-носителем, движутся через колонку. При этом происходит многократное установление равновесия между подвижной газовой и жидкой стационарной фазами, обусловленное многократным повторением процессов растворения и испарения. Вещества, лучше растворимые в стационарной фазе, дольше удерживаются ею. Благодаря этому происходит разделение анализируемой смеси на отдельные компоненты, которые выходят из колонки отдельно и регистрируются на выходе.

Эффективность использования метода ГЖХ в каждом отдельном случае зависит от правильного выбора жидкой фазы, размера частиц и природы твердого носителя, скорости и природы газа-носителя, температуры, количества вводимой пробы, длины колонки и других факторов. Поскольку теоретический учет этих факторов не всегда возможен, эффективность анализа ГЖХ в большой степени зависит от практических знаний и опыта экспериментатора.

Поведение анализируемого вещества в колонке хроматографа можно охарактеризовать временем удерживания (fe), Т. е. временем, прошедшим от момента ввода пробы в колонку до момента появления максимума хроматографического пика этого компонента. Очевидно, что эта величина при прочих равных условиях будет зависеть от объемной скорости газа-носителя (F).

Поэтому хроматографические пики принято характеризовать величиной удерживаемого объема (VR): Удерживаемый объем зависит от размера пробы и ряда других факторов. Поэтому для расчетов применяют не простую величину Vr, а исправленную с учетом времени удерживания несорбирующегося вещества (воздух, инертный газ) - t0; мертвого объема, равного удерживаемому объему несорбирующегося вещества, - Vm, сжимаемости j; массы неподвижной фазы W; абсолютной температуры колонки T и т.д.

Довольно часто пользуются исправленным удерживаемым объемом VR, который представляет собой разность удерживаемого объема вещества и удерживаемого объема газа-носителя: Вдоль каждой колонки существует градиент давления. Поэтому вводят поправочный коэффициент j, который учитывает сжимаемость газа в колонке: где Pi - давление газа-носителя на входе в колонку, а Ро - давление на выходе из колонки. С учетом сжимаемости исправленный удерживаемый объем будет: Пользуются также величиной удельного удерживаемого объема: Эта величина эквивалентна VN при 0 С на 1 г жидкой фазы.

Относительный удерживаемый объем рассчитывают по формуле: где индекс s относится к некоторому внутреннему стандарту, в качестве которого обычно используют нормальные алканы, а индекс х - к данному компоненту пробы.

Газ-носитель. В качестве газа-носителя обычно применяют аргон, гелий, азот, водород, воздух. Выбор газа зависит от типа детектора и некоторых других причин. Чем больше относительная молекулярная масса газа-носителя, тем выше качество разделения компонентов анализируемой смеси (благодаря уменьшению их диффузии). Газы с меньшей молекулярной массой обеспечивают лучшую чувствительность детекторов по теплопроводности.

Наибольшая эффективность хроматографической колонки достигается при постоянной скорости потока газа-носителя. Обычно используются скорости потоков 75-100 мл/мин для колонок с внешним диаметром 6 мм и 25-50 мл/мин для колонок с внешним диаметром 3 мм. Скорость газа-носителя определяется вмонтированными в прибор ротаметрами. Для обеспечения устойчивости газового потока приборы снабжаются стабилизаторами давления. Газы для хроматографии должны быть тщательно осушены, так как вода снижает точность определения. Другие примеси практически не влияют на удерживаемые объемы, но ухудшают стабильность показаний и чувствительность детекторов.

Колонки. Применяемые в ГЖХ колонки представляют собой U-образные или свернутые в спираль металлические трубки длиной от 1 до 5 м и диаметром 3-6 мм, заполненные твердым сорбентом с нанесенной на него жидкой нелетучей фазой. Твердые носители должны быть химически инертными, иметь большую удельную поверхность (обычно 5-10 м2/г) и обладать механической и термической стойкостью. Для обеспечения максимальной эффективности колонки следует использовать носители с узким диапазоном размеров зерен. Наиболее часто рекомендуются диапазоны размеров зерен в мешках: 60/80, 80/100 или 100/120. С уменьшением размеров зерен увеличивается эффективность разделения, но возрастает сопротивление колонки и соответственно время удерживания.

Большинство носителей изготовляют из диатомитовой земли, представляющей собой разновидность водной миккроаморфной двуокиси кремния, содержащей примеси окислов металлов, и огнеупорного кирпича, свойства которого близки к свойствам диатомитовой земли. Огнеупорный кирпич имеет, как правило, более развитую поверхность и предпочтителен для работы с длинными колонками. Носители, изготовляемые на основе диатомитовой земли и огнеупорного кирпича, - это хромосорб, диатом, целатом, S-80 и др. Ряд носителей изготавливают на основе полимеров (анапорт, флуоропак, хромосорб Т, порапак и др.), а также из стекла и двуокиси кремния. В некоторых случаях адсорбент перед нанесением жидкой фазы промывают спиртовой щелочью или слабой кислотой либо обрабатывают диметилдихлорсиланом для увеличения химической инертности.

Эффективность хроматографического разделения компонентов анализируемой смеси во многом зависит от правильного выбора неподвижной фазы. Неподвижная фаза должна обладать очень низким давлением пара при рабочей температуре, так как в противном случае она будет испаряться в процессе работы колонки. Неподвижная фаза должна быть термически стойкой и оставаться в жидком состоянии во всем интервале температур, при которых работает колонка. Она должна обладать достаточной растворяющей способностью по отношению к определяемым веществам. В большинстве случаев для приготовления колонок используют от 1 до 30% жидкой фазы от массы носителя. Колонки с содержанием жидкой фазы более 20% применяют в препаративной хроматографии. Более эффективное разделение, как правило, достигается при использовании колонок с низким содержанием жидкой фазы. Для выбора подходящей неподвижной фазы часто приходится применять метод проб и ошибок. Во многих случаях полезным оказывается правило: "подобное растворяется в подобном". В соответствии с этим такие вещества, как углеводороды, хорошо анализируются на неполярных фазах, а полярные соединения на неполярных фазах делятся плохо и выходят из колонки значительно быстрее, чем неполярные, кипящие при той же температуре.

Детекторы. При помощи детектора измеряют состав газа, выходящего из колонки. В настоящее время используют дифференциальные детекторы, которые позволяют измерять концентрацию компонента в данный момент. При выходе чистого газа-носителя такой детектор дает нулевой сигнал. Наибольшее распространение получили катарометр и пламенно-ионизационный детектор (ДИП). Катарометр регистрирует изменение теплопроводности газа-носителя, вызванное появлением анализируемого вещества. При работе пламенно-ионизационного детектора происходит ионизация анализируемых веществ в процессе их сгорания в пламени водорода. Образующиеся ионы рекомбинируют на электродах. Возникающий при этом ток пропорционален концентрации ионов и напряжению на электродах. Катарометр проще по устройству и удобнее в работе, но значительно менее точен, чем ионизационный детектор. Усиленный сигнал детектора записывается на движущейся диаграммной бумаге в виде хроматографических пиков (см. рис. 24). В основе количественного хроматографического анализа лежит измерение площади регистрируемого пика, которая пропорциональна концентрации вещества в пробе. На современных приборах площадь пика определяется с помощью интегратора. При отсутствии интегратора площадь может быть определена как произведение высоты пика на его полуширину (ширина пика на половине его высоты).

Расчет концентрации анализируемого вещества производят различными методами. При использовании метода абсолютной калибровки предварительно строят калибровочные кривые, связывающие площадь хроматографического пика с концентрацией анализируемого вещества. Затем определяют площадь пика для пробы с неизвестной концентрацией и находят концентрацию по калибровочной кривой. Необходимо точно выдерживать постоянство условий анализа, так как площадь пика зависит от скорости газа-носителя, температуры, метода ввода пробы и других факторов. При соблюдении всех правил относительная ошибка определения составляет менее 1%.

Если постоянство условий проведения анализа по каким-либо причинам выдержать невозможно, используют метод внутреннего стандарта. Калибровка производится при добавлении определенных количеств вещества - стандарта к смеси с известной концентрацией анализируемых веществ. На основании полученных данных строят кривую зависимости содержания исследуемого вещества и отношения площадей пиков исследуемого вещества и стандарта.

Советская промышленность выпускает большое число моделей хроматографов. Одними из наиболее совершенных и распространенных приборов являются хроматографы серии "Цвет-100" (Цвет-101, 102, 103, ... 120 ... 150 и т.д.). Каждая из модификаций представляет определенную комбинацию стандартных блоков (блоки детекторов, блок подготовки газов и т.д.). "Цвет-ПО" является одной из наиболее универсальных моделей хроматографов, предназначенных для количественного и качественного анализа органических и неорганических веществ и определения микропримесей в широком диапазоне температур кипения, а также для анализа агрессивных и неустойчивых соединений на стеклянных колонках. В приборе использована двухколоночная газовая схема с независимой установкой расхода газа-носителя. Колонки набивные U-образные, микронабивные, капиллярные и препаративные. Специальное аналитическое оборудование, поставляемое в комплекте (оборудование для пиролиза), дает возможность анализировать высокомолекулярные вещества, выделять отдельные компоненты для идентификации. Хроматограф снабжен набором детекторов. Максимальная температура колонок 400 С, а испарителя - 450 С. Порог чувствительности ионизационно-пламенного детектора и детектора электронного захвата 1*10в-7, катарометра - 1*10в-3, плотномера - 1*10в-2.

Более новые модели "Цвет-134" и "Цвет-152" могут работать в режиме программирования температуры колонок в диапазоне температур от 50 до 400 С, так как они снабжены не только стеклянными и капиллярными, но и фторопластовыми колонками; порог чувствительности детектора повышен до 1*10в-8.

Высокоэффективная жидкостная хроматография.

В связи с введением в практику фармацевтического производства России GMP. повышается значимость использования современных унифицированных методов анализа, как на предприятиях-производителях:, так и в системе государственного контроля качества лекарственных средств. Базовым методом анализа качества субстанций и готовых лекарственных средств в странах с развитой фармацевтической промышленностью (США, Англия. Япония, страны ЕС) является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Данный метод по своим характеристикам соответствует требованиям количественного анализа около 80-90% препаратов.

Произошедшие за последние 10 лет изменения в фармацевтической отрасли России, направленные на модернизацию производств, интенсифицировали внедрение ВЭЖХ в контроль качества технологического процесса. Организации-разработчики также начали более активно включать ВЭЖХ метод в соответствующие разделы фармакопейных статей и технологических регламентов. Стали появляться хроматографы в региональных органах контроля качества лекарственных средств. Вместе с тем при общей положительной направленности, процесс в значительной мере сдерживается отсутствием общей упорядоченности.