Выделение казеина из молока и альбумина из яичного белка

Липопротеины. Этот класс сложных белков состоит из белка и простетической группы, представленной каким-либо липидом. Липопротеины широко распространены в природе, в растениях, тканях животных и у микроорганизмов и выполняют разнообразные биологические функции. Липопротеины входят в состав клеточной мембраны и внутриклеточных биомембран ядра, митохондрий, микросом (это структурированные липопротеины), а также присутствуют в свободном состоянии (главным образом в плазме крови). К липопротеинам относятся, кроме того, тромбопластический белок ткани легких, липовителлин желтка куриного яйца, некоторые фосфолипиды молока и т. д. Установлено, что липопротеины участвуют в структурной, комплексной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлоропластов, фоторецепторной и электронно-транспортной систем, палочек и колбочек сетчатки и др.

Фосфопротеины занимают особое положение в биохимии фосфорсодержащих соединений не только в результате своеобразия структурной организации, но и вследствие широкого диапазона функций в метаболизме. Большое количество фосфопротеинов содержится в ЦНС.

Характерной особенностью структуры  фосфопротеинов является то, что фосфорная  кислота оказывается связанной  сложноэфирной связью с белковой молекулой через гидроксильные группы β-оксиаминокислот, главным образом серина и в меньшей мере треонина.

К белкам этого класса относятся  казеиноген молока, в котором содержание фосфорной кислоты достигает 1%, вителлин, вителлинин и фосвитин, выделенные из желтка куриного яйца, овальбумин, открытый в белке куриного яйца, ихтулин, содержащийся в икре рыб, и др.

Гликопротеины. Белки это класса весьма прочно связаны с углеводами и их производными. Связь между углеводным компонентом и белковой частью в разных гликопротеинах осуществляется через одну из трех аминокислот: аспарагин, серии или треонин. К биологически активным гликопротеинам относятся открытые в последнее десятилетие интерфероны, синтезируемые в животных клетках в ответ на возбуждение экзогенным стимулятором. Из других гликопротеинов, выполняющих ряд важнейших биологических функций, следует отметить все белки плазмы крови (за исключением альбуминов), некоторые ферменты, а также гликопротеины в составе слюны (муцин), хрящевой и костной тканей и яичного белка (овомукоид).

1.1.4 Альбумины.

 Альбумины - белки относительно небольшой молекулярной массы (15-70 тыс.); они имеют избыточный отрицательный заряд и кислые свойства (изоэлектрическая точка 4,7) из-за большого содержания глутаминовой кислоты. Это сильно гидратированные белки, поэтому они осаждаются только при большой концентрации водоотнимающих веществ. Характерным свойством альбуминов является высокая адсорбционная способность. Они адсорбируют полярные и неполярные молекулы. Благодаря высокой неспецифической адсорбции различных веществ альбумины плазмы крови играют физиологически важную транспортную роль. Яичный альбумин или яичная белковина составляет главную часть органического вещества, заключенного в белке птичьих яиц.

Свойства сухого альбумина. Сухой альбумин представляет полупрозрачную массу белого или бледно-желтого цвета, твердую и ломкую, которая легко растирается в белый порошок. Масса эта не имеет ни вкуса, ни запаха. Она растворяется в воде, но довольно медленно; впрочем, растворимость ее идет быстрее, когда вода содержит какую-нибудь щелочную соль. Сухой альбумин можно подогревать до 100°, и он все еще будет растворяться в воде; при 140° теряет 4% воды, но по-прежнему сохраняет растворимость.

Свойства водяного раствора альбумина. — При нагревании раствор становится мутным при 60°, а между 60° и 75° альбумин переходит в белое нерастворимое вещество, известное под названием свернувшегося альбумина. Вращающая способность раствора очищенной белковины = 38°. Раствор чистого альбумина не изменяет растительных красок. Альбумин не растворяется в спирте и эфире. Крепкий спирт, прибавленный в избытке, осаждает альбумин в свернувшемся состоянии, а небольшое количество разбавленного спирта дает осадок, который вполне растворяется в воде. Если взболтать эфир с раствором альбумина умеренной крепости, то некоторая (малая) часть его свертывается. Азотная кислота осаждает альбумин и служит для обнаружения присутствия растворимого альбумина; нагревание способствует быстрейшему осаждению альбумина. Разбавленная серная кислота дает осадок альбумина только по прошествии некоторого времени. Небольшое количество соляной кислоты не осаждает альбумина, но с большим количеством ее образуется осадок вещества, содержащего эту кислоту. Метафосфорная кислота или раствор ее соли с уксусной кислотой осаждают альбумин. Пирофосфорная, ортофосфорная, уксусная и угольная кислоты не осаждают альбумина. Слабые растворы едкого кали и едкого натра не осаждают альбумина. Кислоты и щелочи производят изменения в свойствах альбумина; изменения эти будут ниже описаны под заглавием альбуминная кислота и альбуминная щелочь. Растворы хлористого натрия и других тому подобных щелочных солей не осаждают альбумина; но если прибавить уксусной кислоты к раствору альбумина, содержащему одну из этих солей, или же прибавить щелочной соли к раствору, содержащему уксусную кислоту, то получается осадок альбумина. Осадок образуют также многие металлические соли, прибавленные в раствор альбумина, например сернокислая соль закиси железа, хлористое железо, серно-медная соль, азотно-серебряная, нейтральные и основные уксуснокислые соли свинца и хлористая ртуть.

Железисто-синеродистый калий осаждает из раствора альбумина, содержащего  уксусную кислоту, преципитат, свободный  от калия. Хлор, бром и фенол свертывают альбумин. Закваска сычуга не дает осадка при обыкновенных температурах.

Кровяной альбумин или белковина крови находится в кровяной сыворотке, в мышечной сыворотке, в лимфе, в млечном соке и в большом изобилии в молозиве (colostrum).

1.1.5. Казеин

 Казеин  (от лат. caseus - сыр), основная белковая фракция коровьего молока. Представляет собой смесь нескольких фосфопротеидов (основные компоненты - α_s, β- и (-казеины) сходной структуры. В коровьем молоке содержание казеина составляет 2,8-3,5% по массе (от всех белков молока – около 80%), в женском - в два раза меньше. Содержание α_s-, β- и (-казеинов от всего казеина составляет соотв. 54,2, 30,1 и 13,3%. В фракцию казеина входит также γ-казеин (2,5% от всего казеина) - продукт частичного протеолиза β-казеина, катализируемого протеиназой молока. Основные компоненты казеина имеют генетические варианты, отличающиеся несколькими аминокислотными остатками. Изучена первичная структура всех казеинов и их физико-химические свойства. Эти белки имеют молекулярную массу около 20 тыс., изоэлектрическую. точку (рI) около 4,7. Содержат повышенные количества пролина (полипептидная цепь имеет β-структуру), устойчивы к действию денатурантов. Остатки фосфорной кислоты образуют сложноэфирную связь главным образом с гидроксигруппой остатков серина. Высушенный казеин - белый порошок без вкуса и запаха, практически не растворим в воде и органических растворителях, растворимы в водных растворах солей и разбавленных щелочей, из которых выпадает в осадок при подкислении. Казеин обладает способностью к створаживанию. Этот процесс имеет ферментативную природу. У новорожденных в желудочном соке содержится особая протеиназа-реннин, или химозин, который отщепляет от (-казеина гликопептид с образованием так называемым пара-(-казеина, обладающего способностью к полимеризации. Этот процесс - первая стадия створаживания всего казеина. У взрослых животных и человека образование пара-(-казеина происходит в результате действия пепсина. По способности к створаживанию казеин сходен с фибриногеномплазмы крови, который при действии тромбина превращается в легко полимеризующийся фибрин. Считается, что фебриноген является эволюционным предшественником казеина. Способность к створаживанию имеет большое значение для эффективной ассимиляции новорожденными молока, т.к. обеспечивает его задержку в желудке.

Казеин легко доступен для пищеварительных протеиназ  уже в нативном состоянии, в то время как все глобулярные белки приобретают это свойство при денатурации. При частичном протеолизе казеина, происходящем при ассимиляции молока новорожденными, образуются физиологически активные пептиды, регулирующие такие важные функции, как пищеварительную, кровоснабжение мозга, активность центр. нервной системы и др. Для выделения казеина снятое молоко подкисляют до рН 4,7, что вызывает выпадение казеина в осадок. Казеин содержит все необходимые организму аминокислоты (в т. ч. незаменимые), является главной составной частью творога и сыра; служит пленкообразователем в производстве клеев и клеевых красок, а также сырьем для пластмасс и волокон.

2. Методы выделения и очистки белков

Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует  проведения последовательных операций, включающих:

• дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
• фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
• экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
• разделение смеси белков на индивидуальные белки.

1. Методы разрушения тканей и экстракции белков

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.

Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в  буферном растворе с определённым значением  рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Метод замораживания  и оттаивания ткани

В результате попеременного  замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани  нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование  гомогената с разной скоростью позволяет  получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и  другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

Экстракция  белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры

Если искомый белок  прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют додецилсульфат натрия. При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.

Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно  удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

2. Методы очистки белков

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся  в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора. Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах. На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при  кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.

Высаливание

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости  при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных  металлов вызывают обратимое осаждение  белков, т.е. после их удаления белки  вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH₄)₂SO₄. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто  используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ  между двумя фазами, одна из которых  подвижная, а другая неподвижная. В  основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают, пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул. Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).