Выделение казеина из молока и альбумина из яичного белка

Ультрацентрифугирование

Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой.После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Электрофорез  белков

Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-). Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам. Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α₁ глобулины, α₂-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 1-57). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Ионообменная  хроматография

Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу), содержащую анионные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный  метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном  взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

1.2.3. Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Для удаления низкомолекулярных  соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью. Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют. Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации. Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Объекты и методы исследования

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Белок куриного яйца.

Химический состав куриного яйца:

Калорийность:156.9ккал 
Вода:74.1г 
Белки:12.7г 
Жиры:11.5г 
Углеводы:0.7г

2.1.2 Коровье молоко

В работе использовалось молоко цельное отборное питьевое пастеризованное  «Бежин луг».  Пищевая ценность ( содержание в 100г продукта):

Жира, г – 3,5

Белка, г – 2,8

Углеводов, г – 4,7

Энергетическая ценность: 61 ккал 

2.2. Методы исследования

2.2.1 Получение кристаллического  яичного альбумина.

Оборудование  и реактивы: цилиндры мерные на 50 и 100 мл; воронки стеклянные; палочки стеклянные; колба для фильтрования под вакуумом с воронкой Бюхнера; стакан стеклянный лабораторный с носиком на 50 мл; фильтры бумажные; универсальная индикаторная бумага; свежие яйца; сульфат аммония (насыщенный); сульфат аммония (порошок); уксусная кислота (4%-ная).

Ход работы:

Белок яиц отделили от желтка и поместили в мерный цилиндр  на 100 мл с притертой пробкой. Прилили равный объем приготовленного насыщенного раствора сульфата аммония. Закрыли пробкой и хорошо перемешали. В осадок выпали глобулины. Их отфильтровали через складчатый фильтр. Фильтрование вели в другой мерный цилиндр меньшего объема. К прозрачному фильтрату прибавили тонко растертый порошок сульфата аммония и длительно перемешивали стеклянной палочкой, добиваясь полного растворения кристаллов. При этом получили 70%-ный раствор сульфата аммония, из которого выпал в осадок в альбумин. Последний отфильтровали на воронке Бюхнера. Осадок сняли с фильтра, перенесли в химический стакан на 50 мл и растворили в минимальном количестве воды. К насыщенному раствору прибавили по каплям 4%-ный раствор уксусной кислоты, контролируя рН полученного раствора по универсальной индикаторной бумаге. По достижению рН=4,7 – 4,8, к раствору прилили небольшими порциями насыщенный раствор сульфата аммония при постоянном встряхивании до тех пор, пока не появилась неисчезающая муть. Стаканчик накрыли чистым стеклом и поставили в холодильник. Через сутки или более выпали игольчатые кристаллы яичного альбумина. Для дальнейшего очищения  белка от примесей применяют  диализ.

Реактивы и оборудование: водный раствор белка; насыщенный раствор хлорида натрия; 0,5 %-й раствор нитрата серебра; 10 %-й раствор азотной кислоты; 10 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-й раствор сульфата меди, пробирки, целлофановый мешочек; стакан.

Ход работы:

В пробирке смешали равные объемы раствора белка и насыщенного раствора хлорида натрия. Влили приготовленный раствор белка в мешочек из целлофана, заполнив его до половины.

Мешочек подвесили на стеклянной палочке и погрузили в стакан с дистиллированной водой. Ионы натрия и хлорид-ионы свободно проникают через стенки мешочка и равномерно распределяются по всему объему воды. Молекулы белка имеют большие размеры, чем размеры пор целлофана, и остаются в мешочке. Диализ проводят при комнатной температуре в течение суток. 

Анализ воды в стакане:

К  жидкости из стакана добавьте 2 капли раствора азотной кислоты и 2–3 капли раствора нитрата серебра. Появляется белый осадок хлорида серебра.

К жидкости из стакана добавьте 5 капель раствора щелочи и 1–2 капли раствора сульфата меди. Фиолетовое окрашивание, характерное для белков, отсутствует.

Анализ содержимого мешочка:

К 5 каплям раствора из мешочка  добавьте 5 капель раствора щелочи и 1–2 капли раствора сульфата меди. Появляется характерное окрашивание, вызванное  образованием комплексной соли меди с белком.

2.2.2. Получение белка казеина.

1 способ:

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки, стакан на 100 мл, колба круглодонная на 50 мл, холодильник, рН-метр, центрифуга, молоко пастеризованное (содержание в 100 г: жир – 3,5г, белок – 2,8г, углеводы – 4,7; энергетическая ценность 61 Ккал), раствор НCl (0,5н), ацетон.

Ход работы: В течение 30 минут прибавляли к молоку 100 мл 0,5н раствора НCl до рН=4,8. Смесь перемешивали в течение 15 минут и дали отстоятся 1час. Верхний слой декантировали, а осадок отфильтровали и промыли дистиллированной водой. Для удаления жиров осадок завернули в фильтровальную бумагу и обработали 25 мл ацетона. Препарат казеина распределили тонким слоем на стекле и оставили на несколько часов для испарения ацетона.

2 способ:

Оборудование  и реактивы: молоко пастеризованное (содержание в 100 г: жир – 3,5г, белок – 2,8г, углеводы – 4,7; энергетическая ценность 61 Ккал), уксусная кислота, едкий натр (1%-ный раствор), серная кислота, спирт,  пробирки, пипетки, стакан на 100 мл, фарфоровая чашка.

Ход работы: 100 мл молока разбавляют 200 мл дистиллированной воды, к раствору прибавляют 6 мл уксусной кислоты. Полученную сыворотку отфильтровывают через складчатый фильтр, промывают водой. Промытую сыворотку, содержащую казеин и жир, растирают в фарфоровой чашке с 3 мл 1%-ного едкого натра. Густую кашицу нейтрализуют, хорошо перемешивая раствором едкого натра (3 мл) той же концентрации, слабо подогревают. Раствор переливают в высокий стакан и оставляют на ночь. Всплывший на поверхность жир отделяют, а раствор отфильтровывают от остатков жира, несколько раз через складчатый фильтр (пока жидкость не будет лишь слегка мутной). Фильтрат снова подкисляют уксусной кислотой (2,4 мл): осадок казеина отцеживают, промывают, еще раз растворяют в щелочи и осаждают уксусной кислотой. Полученный таким образом казеин, возможно полно отжимают, растирая с небольшим количеством спирта в пасту, отсасывают, промывают спиртом и сушат на воздухе. Сухой обезжиренный препарат казеина – белый аморфный порошок.

3 способ:

Оборудование  и реактивы: молоко пастеризованное (содержание в 100 г: жир – 3,5г, белок – 2,8г, углеводы – 4,7; энергетическая ценность 61 Ккал), стакан стеклянный на 500 мл, палочка стеклянная, воронка стеклянная, пипетки, бумага фильтровальная, уксусная кислота 4%-ная, карбонат натрия 0,1%-ный.

Ход работы: При помешивании добавляют к молоку по каплям 4%-ный раствор уксусной кислоты до прекращения выделения казеина. Необходимо избегать избытка кислоты, т.к. казеин растворяется в нем. Кашицу, содержащую казеин, отфильтровывают, через фильтровальную бумагу, промывают 1-2 раза водой. Для очистки от жиров и других веществ казеин растворяют в 0,1%-ном растворе карбоната натрия. Казеин растворяется, жир остается во взвешенном состоянии. Смесь фильтруют через двойной складчатый фильтр, при этом жиры остаются на фильтре. Фильтрат, содержащий натриевую соль казеина снова осаждают 0,1%-ным раствором уксусной кислоты. Осадок казеина отфильтровывают, отжимают между листами фильтровальной бумаги и сушат на воздухе.

 

3. Результаты и обсуждение

Казеин и яичный альбумин широко применяются в пищевой промышленности. Казеин используется как добавка к рациону при затяжных заболеваниях для обогащения организма белком. Яичный альбумин незаменим в кондитерском производстве. Выделенный из исходных продуктов белок – концентрированный и легок в хранении.

 Для получения казеина из молока использовали кислотный способ выделения. Сначала для осаждения казеина приливали кислоту.  После выпадения осадка отфильтровали раствор и для удаления жиров промыли ацетоном. Чтобы ацетон испарился смесь тонким слоем, растирают на стекле.

В другом опыте для  того, чтобы выпали альбумины из молока, добавили уксусную кислоту, так же фильтруют и удаляют жир из фильтрата с помощью едкого натра. Далее смесь фильтруют несколько раз для удаления жиров. Для того чтобы промыть смесь, ее растворяют в уксусной кислоте, еще раз растворяют в щелочи и снова осаждают этановой кислотой. Затем казеин смешивают со спиртом для его нейтрализации. Полученную смесь сушат на воздухе.

В третьем случае выделения  казеина, молоко так же смешивают  с уксусной кислотой. Полученную кашицу отфильтровывают и фильтрат промывают несколько раз водой. Для очистки белка от жиров и других примесей, его растворяют в растворе карбоната натрия. Затем смесь фильтруют, жиры остаются на фильтре. Полученный раствор содержит натриевую соль казеина. Для очищения белка его осаждают уксусной кислотой. Осадок фильтруют и сушат на воздухе.