Ферменты

ФЕРМЕНТЫ

Для студентов  физического факультета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

     Ферменты (от лат. fermentum – закваска) – это уникальные, специфические катализаторы биохимических процессов, присутствующие во всех живых клетках.

     Ферменты  – это особые глобулярные белки (правда, в настоящее время известна одна ферментативная реакция небелковой природы: молекула РНК катализирует свое собственное разрезание на части).Полимерная цепочка белков, состоящая из нескольких сотен звеньев остатков различных типов почти исключительно a-аминокислот, имеет компактную форму.

     Карбоксильная группа одной молекулы аминокислоты, взаимодействуя с аминогруппой соседней молекулы аминокислоты, образует амид. Отдельные пептидные звенья –СО–NH– отличаются друг от друга только боковыми группами R. Эти группы могут содержать свободные амино- или карбоксильные группы, так как некоторые белковые аминокислоты содержат две амино- (лизин) или две карбоксильных (аспарагиновая кислота) группы. Они могут содержать также и амидные группы. Последовательность аминокислот определяет первичную структуру белков. Кроме пептидных связей в белках имеются водородные связи между и , определяющие вторичную структуру (спираль). В белках имеет место также взаимодействие NH₂, OH, COOH-групп, не принимающих участия в образовании пептидной связи (третичная структура). Подробнее о третичной и четвертичной структуре белков можно прочесть в работах [1, 2].

     Ферменты  имеют ряд свойств, общих с  искусственными химическими катализаторами небелковой природы. Это, например, способность катализировать только энергетически возможные реакции путем снижения энергии активации Е_а, направляя реакцию обходным путем через промежуточные реакции, не расходоваться в процессе реакции, ускорять как прямую, так и обратную реакции [3].

     В то же время белковая природа ферментов  обуславливает ряд особенностей, которые коренным образом отличают их от искусственных катализаторов [4, 5].

     Во-первых, это необыкновенно высокая эффективность действия. Например, относительная скорость для реакции разложения перекиси водорода 2H₂O₂®2H₂O + O₂ при температуре 300 К, идущей с гетерогенным платиновым катализатором, который снижает энергию активации Е_а с 70 кДж/моль до 45 кДж/моль, равна 2,2×10⁴. Если в качестве катализатора этой реакции использовать фермент катализу, то энергию активации можно снизить до Е_а=7 кДж/моль. При этом относительная скорость равна 9,3×10¹⁰! Таким образом, ферментативные реакции протекают очень быстро. Обычно их скорость составляет несколько тысяч актов в секунду, а иногда доходит до миллиона.

     Известны, однако, и медленно работающие ферменты, например, пепсин. Под действием  этого катализатора расщепление  белков в желудке идет со скоростью  всего лишь 10 актов в секунду.

     Второй  отличительной особенностью ферментов является чрезвычайно высокая специфичность по типу реакции. Определенный фермент катализирует строго определенную реакцию. Например, фермент трансаминаза отщепляет от аминокислоты только аминогруппу, а декарбоксилаза – только карбоксильную.

     Третьей особенностью ферментов является их высокая субстратная специфичность. Даже если какая-то реакция может идти с разными соединениями, данный фермент будет работать только с одним (или немногими).

     Если  фермент действует только на один субстрат, то говорят об абсолютной специфичности. Например, фермент аспартаза катализирует реакцию:

фумаровая кислота + аммиак

     Этот  фермент не действует ни на какие  другие соединения.

     Некоторые ферменты катализируют превращение  веществ, имеющих общие структурные особенности. Такие ферменты имеют относительную (групповую) специфичность. Например, химотрипсин гидролизует те пептидные связи, которые образованы карбонильной группой ароматических аминокислот.

     Если  фермент катализирует превращение одного из стереоизомеров субстрата, то говорят о стереохимической специфичности. Например, упомянутая выше аспартаза не действует на малеиновую кислоту или на D-аспарагиновую кислоту.

     Стереохимическая  специфичность ферментов теснейшим  образом связана с одной из основных особенностей живых организмов – их способностью к синтезу оптически активных органических соединений.

     Существуют  также ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но представленные различными молекулярными формулами. Если это обусловлено генетическими причинами, то говорят об изоферментах.. Изоферменты различаются по физико-химическим свойствам и могут быть отделены друг от друга путем электрофореза, хроматографически или другими методами. Для каждого органа характерен определенный набор изоферментов. Поэтому при некоторых заболеваниях, сопровождающихся разрушением клеток или повышением проницаемости мембран, в крови повышается активность тех изоферментов, которые преимущественно содержатся в пораженном органе. Так, например, фермент креатинфосфокиназа существует в виде трех изоферментов, обозначаемых ММ, МВ и ВВ. Креатинфосфокиназа МВ преимущественно содержится в сердечной мышце. Поэтому при инфаркте миокарда его активность в плазме крови повышается, что может быть использовано в диагностике этого заболевания. (С проблемами современной энзимодиагностики можно ознакомиться в работе [6]).

     До  середины 60-х годов количество обнаруживаемых в природе ферментов исчислялось  сотнями, в настоящее время их несколько тысяч. Можно надеяться, что сейчас нам известны все ферменты, участвующие в основных метаболических процессах. Однако возможны и неожиданности. Так совсем недавно был открыт новый фермент, синтезирующий в человеческом организме оксид азота NO, из давно известной аминокислоты аргинина.

     Все ферменты разделяются на две большие  группы: однокомпонентные, состоящие только из белка, и двухкомпонентные, состоящие из белка, называемого апоферментом, и небелковой частью, называемой простетической группой. Апофермент называют также белковым носителем, а простетические группы – активными группами, которые для многих ферментов представляют собой производные витаминов или нуклеотидов.

     Например, двухкомпонентным ферментом является пируватдекарбоксилаза, катализирующая расщепление пировиноградной кислоты на двуокись углерода и уксусный альдегид:

CH₃COCOOH

     В данном случае простетическая группа фермента, тиаминпирофосфат, образована молекулой тиамина (витамина В₁) и двумя остатками фосфорной кислоты.

     Простетические группы, легко отделяющиеся от белковой части фермента, называются коферментами. Активностью обладает только комплекс апофермент + кофермент, называемый холоферментом.

     Исключительно высокая специфичность действия ферментов объясняется их белковой природой. Так пиридоксалевые ферменты, содержащие один и тот же кофермент (пиридоксальфосфат), могут принадлежать к различным классам и катализировать самые разнообразные реакции. Специфичность их действия зависит от природы апофермента.

     Многие  ферменты содержат металлы, без которых фермент не обладает активностью. Эти металлы называют кофакторами.

ОСНОВНЫЕ  ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ УЧЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ

     Термин  «фермент» был предложен в  начале 17 в. голландским естествоиспытателем Я.Б. Ван-Гельмонтом (1579 - 1644). Однако он был виталистом и считал, что жизненные процессы реализуются особыми «духами жизни» («археями»). «Ферментом» он называл неизвестный агент, активно участвующий в процессе спиртового брожения.

     Первое  научное представление о ферментах  было высказано русским химиком К.Г.С. Кирхгофом (1764 – 1833). В 1811 г. Он сообщил о превращении крахмала в сахар, а в 1814 г. открыл ферментативное действие водных вытяжек из проросшего ячменя, расщепляющих крахмал [7]. Можно считать, что эти работы положили начало науки о ферментах как самостоятельному разделу органической химии.

     Спустя 19 лет, в 1833 г. французскими химиками А. Пайеном и Ж. Персо впервые был выделен из солода препарат фермента амилазы. Их работы послужили толчком для выделения и получения ферментов и способствовали развитию препаративной химии.

     В середине 19 в. разгорелась дискуссия о природе брожения между французским микробиологом и химиком Л. Пастером (1822 – 1895) с одной стороны, и немецким химиком Ю. Либихом (1803 – 1873), французским химиком П.Э.М. Бертло (1827 – 1907) и французским физиологом К. Бернаром (1813 – 1878), с другой.

     Опираясь  на свои экспериментальные исследования, Л. Пастер развивал представление о  том, что брожение вызывается лишь живыми микроорганизмами и что этот процесс  неразрывно связан с их жизнедеятельностью.

     Сторонники  Ю. Либиха развивали представление  о химической природе брожения, считая, что оно является следствием образования  в клетках микроорганизмов, подобных выделяемой из солода амилазе.

     Здесь уместно напомнить, что в то время  собственно ферментами называли «организованные ферменты», то есть сами живые организмы. Термин же энзим (от греческого en – в, внутри и – закваска) был введен В. Кюне в 1876 г. для «неорганизованных ферментов», которые секретируются  клетками в желудок или кишечник. Теперь эти термины используются как синонимы.

     Спор  длился несколько десятилетий.

     Открытие  аналогии между каталитическими  химическими и ферментативными  реакциями получило подтверждение  в работах П.Э.М. Бертло, Х.Ф. Шенбайна и др. Были также попытки теоретически обосновать каталитический механизм ферментативных реакций [8].

     Однако  выделить из разрушенных дрожжевых  клеток растворимый катализатор, способный  вызвать брожение, долго не удавалось.

     И только через два года после смерти Л. Пастера (в 1897 г.) Э. Бюхнер опубликовал работу «Спиртовое брожение без дрожжевых клеток», в которой экспериментально показал, что бесклеточный дрожжевой сок осуществляет спиртовое брожение так же, как и неразрушенные дрожжевые клетки. Растирая дрожжи с инфузорной землей, Э. Бюхнер выделил из них бесклеточный растворимый ферментативный препарат и назвал его зимазой. Открытие Э. Бюхнера поставило точку в долгом споре и имело большое значение для дальнейшего развития энзимологии.

     Н.Н. Чернов напоминает нам [9] имя первой женщины биохимика Марии Михайловны Манассеиной (урожденной Корнаковой, 1843 – 1911).

     За 25 лет до Э. Бюхнера она на немецком и русском языках опубликовала результаты своих экспериментальных исследований, доказывающих образование спирта в суспензии убитых клеток.

     Британский  исследователь Джон Лагнадо в  работе [10] сообщает, что отыскал  в Британском музее статью М.М. Манасеиной от 1872 г., которая содержит детальный  анализ экспериментов, проведенных  ею во время стажировки в Политехническом институте г. Вены у профессора Ю. Вайснера. Эта статья завершается выводом о том, что живые клетки совсем не обязательны для алкогольного брожения. Сама Манассеина полностью осознавала фундаментальность своей работы. Эту статью заметил Ю. Либих и пригласил автора продолжить исследования в его лаборатории в Гессене. К сожалению, М.М. Манассеина по семейным обстоятельствам должна была вернуться в С.-Петербург, где в последствии прославилась своими работами по высшей нервной деятельности.

     Э. Бюхнер прекрасно знал о работах М.М. Манассеиной, но никогда на них не ссылался. В 1907 г. он был удостоен Нобелевской премии, а имя М.М. Манассеиной на ее родине не упоминается ни в энциклопедиях, ни в справочниках.

     Начиная с 1897 г. ведется постоянная работа по выделению и очистке ферментов. Это касается, в первую очередь, ферментов, действующих вне вырабатывающих их клеток, например, пищеварительных ферментов.

     Надо  заметить, что такая работа велась и раньше. Так русский биохимик А.Я. Данилевский (1838 – 1923) впервые предложил и разработал адсорбционный метод разделения ферментов поджелудочной железы и разделил трипсин и амилазу еще в 1862 г. (Кстати позднее он же предложил теорию строения белковой молекулы).

     Однако, широко адсорбционный метод начал  применяться только в 20 в. И, в первую очередь, здесь следует отметить работы Р. Вильштеттера (1872 – 1942) и сотрудников. Этот известный немецкий химик и биохимик (Нобелевская премия 1915 г. за работу, посвященную химическому строению алкалоидов, кровяных пигментов и хлорофилла), применяя в своих исследованиях адсорбционный метод, внес существенный вклад в энзимологию. Но его работы имели и отрицательное значение. Дело в том, что, изучая свойства отдельных ферментов, он сделал принципиально неправильный вывод о том, что ферменты не принадлежат ни к одному из известных классов органических соединений.

     Безусловно, выдающимся успехом в выяснении  химической природы ферментов следует  считать работы американских биохимиков Дж.Б. Самнера и Дж.Х. Нортропа.