Ферменты

     Впервые в 1926 г. Дж.Б. Самнер выделил в кристаллическом виде из семян канавалии фермент уреазу. А вслед за ним Дж.Х. Нортроп (с сотрудниками) впервые выделил в кристаллическом виде протеолитические ферменты: пепсин (1830 г.), трипсин (1932 г.) и другие. Работы этих выдающихся ученых указали путь получения высокоочищенных кристаллических препаратов ферментов и вместе с тем неопровержимо доказали белковую природу ферментов.

     В 1946 г. Дж.Б. Самнер, Дж.Х. Нортроп и У.М. Стэнли (вирусолог) за работы в области энзимологии и вирусологии удостоены Нобелевской премии по химии.

     Другим  важным условием прогресса в изучении ферментов было дальнейшее углубление знаний о кофакторах ферментов. В  начале 30-х годов были получены в  чистом виде органические коферменты ферментативных процессов биологического окисления (коферменты гидрогеназ и желтых окислительных ферментов).

     Здесь, прежде всего, следует отметить работы немецкого биохимика и физиолога  О.Г. Варбурга, который за открытие природы и функций двухатомных ферментов в 1931 г. был удостоен Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Работы О.Г. Варбурга расширили представление о механизме окислительно-восстановительных процессов в живой клетке.

     В 1937 г. были удостоены Нобелевской  премии швейцарский химик-органик  и биохимик П. Каррер и английский химик-органик У.Н. Хоуорс. П. Каррер установил строение и синтезировал ряд биологическии активных природных соединений, в том числе витаминов А, В₁, Е, К и их коферментные формы.

     А в 1938 г. за работы по каротиноидам и  витаминам получил Нобелевскую  премию немецкий биохимик Р. Кун.

     В середине 20 в. благодаря развитию методов  физико-химического анализа и  методов белковой химии расшифрована структура многих ферментов. Так  американские биохимики С. Мур, У. Стайн и К. Анфинсен, применяя хроматографические методы химического анализа (автоматическую аппаратуру для хроматографического разделения и количественного определения аминокислот), в 1956 г. показали, что фермент рибонуклеаза из поджелудочной железы быка представляет собой полипептидную цепочку, состоящую из 124 аминокислотных остатков, соединенных в 4-х местах дисульфидными связями. Таким образом, впервые появилась возможность создания полной модели фермента. За основополагающий вклад в химию ферментов эти ученые в 1972 году были удостоены Нобелевской премии.

     С помощью рентгеноструктурного анализа  расшифрована вторичная и третичная  структура ряда ферментов. Так в 1965 г. английский ученый Д. Филлипс методом рентгеноструктурного анализа  установил трехмерную структуру лизоцима. Было показано, что многие ферменты обладают также и четвертичной структурой, то есть их молекула состоит из нескольких идентичных или различных по свойству и структуре белковых субъединиц.

     Работы  по изучению строения ферментов развиваются  по трем направлениям: изучение строения белковой части, исследования простетических групп, способа присоединения коферментов к белку и принципа их функционирования [11].

     Бурные  темпы развития энзимологии повлекли за собой возникновение определенных затруднений в систематизации информации, что затрудняло обмен опытом в этой области. Поэтому Международным биохимическим союзом была создана Комиссия по ферментам, которая в период с 1957 по 1961 г. разработала рациональные предложения по упорядочению состояния систематики и номенклатуры ферментов, энзимологической терминологии и символики. Предложенная классификация и номенклатура были утверждены на заседании Генеральной ассамблеи Международного биохимического союза, которое состоялось в 1961 г. в Москве.

     Согласно  принятой классификации, ферменты разделили на 6 классов: 1) оксиредуктазы, 2) трансферазы, 3) гидролазы, 4) лиазы, 5) изомеразы, 6) лигазы. Шифр каждого фермента содержит четыре числа, разделенных точками. Первая цифра указывает класс, вторая – подкласс, третья подподкласс, четвертая – порядковый номер в данном подподклассе.

     Например, фермент аргиназа, расщепляющий аргинин  на орнитин и мочевину, имеет шифр 3.5.3.1, то есть относится к классу гидролаз, подклассу ферментов, действующих  на непептидные С – N – связи, и подподклассу ферментов, расщепляющих эти связи в линейных (не циклических соединениях).

     Кроме шифра, классификация и номенклатура ферментов включает также систематические  и тривиальные (рабочие) названия. Систематическое  название состоит из двух частей. Первая часть представляет собой название субстрата, вторая часть с окончанием «аза» указывает на катализируемую ферментом реакцию. В качестве тривиальных названий ферментов в большинстве случаев сохранены общепринятые традиционные названия. Например, фермент расщепляющий гидролитическим путем мочевину на аммиак и гидроксид углерода (относится к классу гидролаз, шифр 3.5.1.5) имеет систематическое название: «мочевина-амидогидролаза», а тривиальное – «уреаза». Систематическому названию L-аргинин-амидиногидролаза соответствует рабочее – аргиналаза [12 – 13].

     Так как ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых количествах, то непосредственно определяют не концентрацию фермента, а его активность, о  которой судят по скорости ферментативной реакции.

     Рекомендована международная единица активности фермента (М.Е.). Одна международная единица соответствует тому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за  
1 мин в оптимальных для этого фермента условиях. Единицей активности в системе СИ является катал (кат) и его производные (мкат и др.). Один катал – это количество фермента, которое необходимо для каталитического превращения одного моля субстрата за 1 сек.

     Остановимся кратко на представлениях о механизме  действия ферментов. Для объяснения механизма действия было предложено много теорий. Все они исходят из экспериментально установленного факта, что биокатализаторы не могут сделать возможным протекание процессов, запрещенных с точки зрения термодинамики, они увеличивают скорость разрешенных процессов, снижая энергию активации. Таким образом, ферменты сокращают время достижения состояния подвижного равновесия, при этом в равной мере возрастает скорость как прямой, так и обратной реакции.

     К фундаментальным представлениям о  ферментативном катализе относится  положение о многоступенчатом характере превращения веществ под действием белкового катализатора.

     Впервые гипотезу о том, что в основе ферментативных реакций лежит обратимое взаимодействие субстрата с ферментом (с образованием комплекса) высказали в начале 20 в. А. Браун и затем В. Анри. Доказали это Л. Михаэлис и М. Ментен, а позже Г.Э. Бриггс и Дж.Б.С. Холдейн.

     Начало  современным представлениям о механизме  действия ферментов было положено работой  немецких ученых Л. Михаэлиса и М. Ментен, опубликованной в 1913 г. Согласно теории Михаэлиса-Ментен, первым этапом любого ферментативного процесса является реакция между ферментом Е и субстратом S, приводящая к образованию (с константой скорости k₁) промежуточного фермент-субстратного комплекса ЕS, который может диссоциировать на фермент и субстрат с константой скорости k_–1 и подвергаться практически необратимому расщеплению и исходный фермент и продукт Р – с константой скорости k₂. Если [S]_o>>[Е]_o то концентрация комплекса [ES]=const и начальная скорость двухстадийной ферментативной реакции v ₀ описывается уравнением:

v ₀ 

где V – максимальная скорость реакции, достигаемая при полном насыщении фермента субстратом, а соотношение констант получило название константы Михаэлиса. Из этого уравнения видно, что константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимально возможной. Если k₂ мала пренебрежимо, то , где K_S – константа субстрата, которая служит мерой сродства субстрата к ферменту.

      В том случае, когда определяемые из опыта константы k₂ и K_S или K_M являются эффективными величинами (зависящими от pH среды, присутствия в системе ингибиторов или активаторов, наличия дополнительных стадий и т.д.)? их называют соответственно «каталитической константой» (К_кат) и «кажущейся константой» Михаэлиса (К_М(каж)).

      Уравнение v  называют уравнением Михаэлиса-Ментен. Оно иллюстрирует гиперболическую зависимость скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата и линейную зависимость – от концентрации фермента.

      Кинетические  параметры (k_кат и К_М(каж)) обычно определяют, проводя линеаризацию экспериментальных данных, чаще в координатах Лайнуивера-Берка (1/v ₀ , 1/[S]_o).

      В 50-х годах проблема механизма действия ферментов атаковалась по двум направлениям: создание общих теорий ферментативного действия и изучение деталей строения отдельных активных центров.

      Интересна судьба теорий ценных реакций, которые  были применены для объяснения ферментативных, а именно окислительных процессов. Разработанные механизмы можно подразделить на две группы. Первая группа гипотез стремилась объяснить цепные механизмы реакций для оксидаз и дегидрогеназ. Вторая группа гипотез допускала осуществление всего процесса в пределах ферментативного комплекса и поэтому не связывала процесс с передачей цепи лишь посредством свободных радикалов. В результате было выяснено, что использование цепных механизмов не применимо для объяснения ферментативных процессов, так как не объясняет специфичность действия ферментов и его обратимость.

      В 60-х годах были опубликованы ряд  монографий по кинетике ферментативных процессов. Первая монография вышла  в 1958 г. на английском языке, ее авторами были М. Диксон и Э. Уэбб. В русском переводе он появилась в 1961 году. Книга М. Диксона и Э. Уэбба  [14] – это курс общей энзимологии, ибо в ней описываются общие для всех ферментов свойства, закономерности каталитического действия и т. д. Также большой интерес представляет монография П. Ашмора [15], в которой охватываются механизм действия катализаторов и кинетика каталитических реакций.

      Большой вклад в развитие отечественной  энзимологии внес И.В. Березин. Им созданы и развиты методы анализа ингибирования ферментативных реакций, развиты кинетические модели полиферментных реакций, процессы электронного транспорта, методы иммобилизации ферментов. Заложены основные методы иммуноферментного анализа, биолюминесцентного анализа, а также создания светорегулируемых ферментов (бессеребряной ферментной фотографии) [16].

      Большой вклад в исследование механизма  действия ферментов и его структуры  внесли А.А. Клесов [17 – 19], К. Мартинек [20], М.В. Волькенштейн [21], Ч. Уолтер [22] и другие.

      Подробно  история развития отечественной  энзимологии изложена в обзоре [23].

      В свое время было предложено несколько  вариантов "узнавания" фермента субстратом. Первоначально была принята идея Э. Фишера о том, что субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку [24]. Д. Кошланд [25] выдвинул идею индуцированного соответствия фермента и субстрата, согласно которой субстрат вызывает изменение конформации активного центра фермента [11, 21, 25 – 27]. Высказывалась также идея о том, что при связывании фермента и субстрата возникает принудительная деформация субстрата, что приводит к изменению положения электронной плотности [28, 29]. М.В. Волькенштейн предложил "капельную" модель фермента [30]. Были выдвинуты концепции, предполагающие, что белок в растворе имеет несколько конформаций и субстрат выбирает одну активную конформацию. Описанный механизм был назван конформационной адаптацией [31] и флуктуационным соответствием [32]. Рассмотрение всех концепций ферментативного катализа подробно дано в обзорной статье Е. М. Попова [33].

      Исследование  зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата является обязательным элементом изучения любого фермента, так как оно позволяет оценить основные черты механизма катализируемой им реакции и получить количественную кинетическую характеристику процесса.

      Исследование кинетики ферментативных реакций в стационарном режиме – один из наиболее распространенных способов изучения механизма действия фермента [14, 22, 34, 35]. При исследовании реальных ферментативных систем условие стационарности выполняется приблизительно. Для того чтобы можно было применить принцип стационарности, достаточно, чтобы скорость изменения концентрации промежуточного соединения была много меньше скорости изменения в растворе концентрации субстрата и продукта. Для реакций, протекающих более сложными путями, чем механизм Михаэлиса-Ментен [36], для выполнения стационарности необходимы дополнительные условия, определяемые соотношением констант скоростей индивидуальных стадий.