Гепатит а и его неспецифическая диагностика

       Определение рекомендуется осуществлять сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

       Для избежания ошибки, связанной с появлением мутности, рекомендуется ставить контрольные пробы на каждую сыворотку.

        В качестве унифицированного метода для определения билирубина и его фракций в сыворотке крови предложен способ Иендрашика, Клеггорна и Грофа с измерением оптической плотности азопигмента в нейтральной или слабокислой среде при зеленом светофильтре (530 нм).

       Методом выбора может служить щелочной способ с измерением оптической плотности зеленого (или синего) азопигмента при красном светофильтре (600—610 нм).

       Отечественной промышленностью освоено широкое производство наборов для определения билирубина в сыворотке Крови по методу Йендрашика, Клеггорна, Грофа.

        Помимо выбора наиболее приемлемого метода определения билирубина-необходимо было унифицировать и построение калибровочных кривых.

        На окраску билирубина оказывает существенное влияние наличие белка в пробе, поэтому все стандартные растворы билирубина должны содержать белок. Правда, в поддержании постоянной концентрации белка нет особой необходимости, поскольку окраска азобилирубина не меняется даже при 50-кратном разведении белка. Цвет азобилирубина в белковых растворах оказывается интенсивнее, чем окраска билирубина в слабых щелочных растворах. Вот почему способы приготовления стандартных проб билирубина на белковых растворах являются наиболее правильными. К ним относится получение билирубинового стандартного раствора в буферированной сыворотке человека по Шеллонгу и Венде.

      Очень простой и удобный способ приготовления билирубинового стандарта предложила Комиссия по стандартизации и автоматизации биохимических исследовательских методов Чехословакии.

   Построение калибровочной кривой по Шеллонгу и Венде и способом, предложенным Комиссией по стандартизации в ЧССР, приводится при изложении метода колориметрического определения билирубина и его фракций.

    Наиболее высокой чувствительностью обладает флюориметрический способ исследования билирубина.

Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику, Клеггорну, Грофу)

Принцип. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая, реагируя со связанным билирубином сыворотки, дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива несвязанный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности последнего фотоколориметрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным билирубином находят содержание несвязанного билирубина, дающего непрямую реакцию.

 

   Средние величины содержания различных фракций билирубина: общий билирубин — 11,12 мкмоль/л (0,65 мг/100 мл) связанный билирубин — 2,57 мкмоль/л (0,15 мг/100 мл) свободный билирубин — 8,56 мкмоль/л (0,50 мг/100 мл) [5].

   Определение билирубина в малом объеме сыворотки крови

При выявлении гипербилирубинемии у новорожденных в роддомах, в детских учреждениях можно применять микрометод в модификации Т. Б. Доброседовой и А. С. Циркиной.

Количество сыворотки, необходимое для исследования общего, связанного и свободного билирубина, составляет 0,4 мл. Сыворотку разводят равным объемом физиологического раствора. Дальнейшее определение проводят согласно схеме (табл. 1).

Таблица 1

Данные для определения билирубина в малом объеме сыворотки крови

Реактив	Общий билирубин	Связанный билирубин	Контрольная проба
Сыворотка, разведенная физиологическим раствором 1:1	0.25	0.25	0.25
Кофеиновый реактив	2.00	----	2.00
Физиологический раствор	----	2.00	0.25
Диазосмесь	0.25	0.25	----

 

      Колориметрию и расчет производят так же, как это рекомендуется в унифицированном методе; поскольку сыворотки взято в опыт 0,125 мл, полученный результат умножают на 4 (при учете разведения) .

     Норма—до. 20,52 мкмоль/л (1,2 мг/100 мл) общего билирубина, из которого до 25 % может составлять связанный билирубин.

     Примечание. Реактивы готовят так же, как и в унифицированном методе Йендрашика, Клеггорна, Грофа.

     В связи с тем что билирубин сыворотки крови обладает характерной зоной светопоглощения в области 450 нм, в последние годы были предложены прямые фотометрические методы его определения. Их использование особенно важно в практике экспресс-анализа гипербилирубинемии. Л. Г. Чеховской и А. С. Циркиной был предложен колориметрический экспреcc-метод без применения каких-либо реактивов, состоящий в установлении содержания билирубина путем фотометрии проб на ФЭКе с синим светофильтром (длина волны 450 им является оптимальной). Этот способ может быть эффективен для быстрой ориентировочной оценки уровня билирубина в сыворотке крови при массовых обследованиях населения.

     Hefe (1978), исследовав визуально 1691 сыворотку, нашел, что вначале необходимо провести тщательную визуальную оценку сыворотки и что количественно билирубин следует определять только в иктеричных сыворотках.

    Для полуколичественного  установления билирубина в сыворотке крови Schyfz разработал «Bilur Test» (ФРГ). В основе его лежит цветная реакция взаимодействия билирубина с диазониевой солью 2,6-дихлор-бензол-флюоборатдиазония. Через 1 мин после пропитывания полоски сывороткой появляющуюся окраску сравнивают с приданной цветной шкалой. С помощью этих полосок можно быстро ориентироваться в степени гипербилирубинемии.

Клинико-диагностическое значение определения билирубина в сыворотке (плазме) крови

Определение общего билирубина и его фракций имеет большое клиническое значение. Отмечено, что желтуха появляется тогда, когда уровень билирубина в крови превышает 27—34 мкмоль/л (Тодоров, 1968).

Возрастание содержания свободного билирубина в крови наблюдается при так называемых надпеченочных желтухах, к которым относятся гемолитические анемии разнообразного происхождения, а также функциональные гипербилирубинемии: постгепатитная гипербилирубинемия, болезнь Жильбера, желтуха новорожденных (физиологическая), семейная негемолитическая желтуха новорожденных (синдром Криглера — Найара). Свободный билирубин в моче не появляется. Содержание уробилина в моче и стеркобилина в кале при гемолитических анемиях повышено, при остальных формах надпеченочных желтух оно нормально или понижено.

      У больных  с печеночными желтухами в  крови повышен уровень связанного  билирубина. Как известно, печеночные  желтухи, паренхиматозные повреждения печени с их исходами — это и синдром Дубина— Джонсона и синдром Ротора. В моче появляется билирубин. Количество стеркобилина в кале понижено. Характер уробилинурии различен.

      При подпеченочных  желтухах, к которым относится  механическая желтуха, в крови возрастает содержание как связанного, так и свободного (в меньшей степени) билирубина, в моче, обнаруживается билирубин, в кале понижено содержание стеркобилина.

       В настоящее  время широко известно понятие  «функциональные гипербилирубинемии», под которыми понимают несколько  типов желтух, отличающихся доброкачественным  течением и протекающих без  выраженного поражения паренхимы  печени, без признаков вне-или  впутрипеченочной закупорки желчных  ходов, а также без повышенного гемолиза. В зависимости от того, на каком этапе нарушается обмен билирубина, различают две основные формы гипербилирубинемии, характеризующихся:

1) увеличением содержания  в сыворотке крови свободного  билирубина;

2) накоплением в сыворотке  крови преимущественно связанного  билирубина.

К первому типу функциональных гипербилирубинемии, сопровождающихся повышением концентрации свободного билирубина, относится форма, описанная Жильбером, а также постгепатитная гипербилирубинемия, физиологическая желтуха новорожденных и семейная негемолитическая желтуха новорожденных Криглера— Найара. Эти заболевания протекают без повышенного гемолиза, с пониженным содержанием стеркобилина и уробилина.

      Полагают, что при указанном виде гипербилирубинемии  ухуд-

шается конъюгация билирубина в печеночной клетке вследствие снижения активности глюкурониловой трансферазы или нарушения захвата билирубина печеночной клеткой. Последнее может быть обусловлено и внепеченочными факторами.

    Увеличение концентрации связанного и отчасти свободного билирубина свойственно желтухам, возникающим в результате поражения паренхимы печени факторами инфекционного и токсического характера. Помимо нарушения экскреции связанного билирубина в желчные капилляры, вследствие чего он попадает непосредственно в кровь, отмечается ослабление конъюгации свободного билирубина и поступление его в печеночную клетку. Это влечет за собой повышение уровня и свободного билирубина в плазме крови у таких больных.

         Характерно возрастание связанного билирубина для второй группы функциональных гипербилирубинемии, к которым относятся болезнь Дубина — Джонсона и синдром Ротора. Развитие подобных желтух вызвано нарушением транспорта связанного билирубина печеночной клеткой [5].

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИНОТРАНСФЕРАЗ (ТРАНСАМИНАЗ)

При участии аминотрансфераз (КФ 2.6.1) в организме человека осуществляются процессы переаминирования (обратимого переноса аминогрупп аминокислот на кетокислоты). Наибольшее значение имеет исследование активности аспартатаминотрансферазы (L-аспартат: 2-оксоглутарат-аминотрансферазы; КФ 2.6.1.1) и аланинамино-трансферазы (L-аланин: 2-оксоглутарат-аминотрансферазы; КФ 2.6.1.2). Эти ферменты обладают большой каталитической активностью и широко распространены в различных органах и тканях — печени, мышце сердца, скелетной мускулатуре, почках и других.

     Аспартатаминотрансфераза (АсТ) катализирует реакцию:

Глютаминовая + Щавелевоуксусная → Аспарагиновая + α-кетоглутаровая           кислота                    кислота               ←                                  кислота                                                                                                                                                                                                                                                                                             

   Аланипаминотрансфераза (АлТ) катализирует реакцию:

Глютаминовая + Пировиноградная →α-аланин + α-кетоглутаровая кислота            кислота                       кислота        ←                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                    

      Существующие методы определения активности указанных аминотрансфераз в сыворотке крови можно разделить на две основные группы: колориметрические и спектрофотометрические.

       В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга. Эти методы являются наиболее специфичными и точными для исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови. Однако применение труднодоступных и дорогостоящих реактивов, а также необходимость измерения результатов на спектрофотометре не дают возможности широкого использования этих методов в клинических лабораториях.

       Группа колориметрических методов основана на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакции переаминирования. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента.

Пировиноградная кислота+Динитрофенилгидразин = Динитрофеннлгидразон пировиноградной кислоты

      Динитрофепилгидразоновые методы впервые предложили в 1950 г. Тангази, Уайт, Умбрайт. У нас в стране они получили известность в модификации Т. С. Пасхиной.

      В последние годы появился облегченный и упрощенный метод Райтмаиа и Френкеля, основанный па том же принципе, что и способ в модификации Т. С. Пасхиной, но имеющий перед ним ряд преимуществ. Они состоят в исключении из хода определения активности ферментов: 1) перевода щавелевоуксусной кислоты в пировиноградную с применением анилина, 2) экстракции 2,4-ДНФ-гидразона пирувата толуолом. Метод Райтмана и Френкеля нашел широкое применение за рубежом. Будучи технически простым, он вместе с тем выявляет изменения активности фермента при различных заболеваниях и дает воспроизводимые результаты.

      Азометоды основаны на образовании цветного соединения между щавелевоуксусной кислотой и 6-бензамидо-4-метокситолуидиндиазо-ниевым хлоридом. Колориметрические методы этой группы просты и при наличии соответствующих все еще дефицитных реактивов могут быть использованы для быстрого ориентировочного определения активности аспартатаминотрансферазы [5].