Культури рослинних тканин та клітин

 

 

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

           НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

 

 

 

кафедра Біотехнології та мікробіології

 

 

 

РЕФЕРАТ НА ТЕМУ:

«КУЛЬТУРИ РОСЛИННИХ ТКАНИН ТА КЛІТИН »

 

 

 

 

 

 

Київ 2014

 

ЗМІСТ	Стор.
ВСТУП	3
1. Основні напрями клітинної інженерії рослин…………………….	4
2. Культури клітин вищих рослин…………………………………...	5
3. Клітинна селекція………………………………………………….	6
4. Культури гаплоїдних клітин…………………………………..	8
5.Культури  ізольованих клітин і тканин  …………………………….
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

 

 

 

 

 

 

 

ВСТУП

Лінії рослинних клітин є продуцентами корисних речовин. Вони здатні накопичувати цінні продукти в кілька разів більше, ніж самі рослини. Так, мутантні клітинні лінії раувольфії зміїної містять у 10 разів більше цінного для медицини алкалоїду аймаліну, ніж рослини. Створено штам клітин рути пахучої, який містить у 220 разів більше алкалоїду, ніж дика рослина. Культивування рослинних клітин використовується у промислових масштабах для одержання фізіологічно активних сполук. Налагоджене виробництво біомаси женьшеню для потреб косметичної і медичної промисловості. Інший напрям клітинної інженерії - це мікроклональне розмноження рослин на основі культури тканин. За допомогою цього методу з однієї клітини одержують від 10 тисяч до 1 млн рослин за рік. Методи клітинної інженерії дозволяють скоротити процес селекції з 10 - 12 до 3 - 4 років.

Перспективним способом виведення нових сортів є метод злиття клітин, що дозволяє отримувати гібриди, долаючи міжвидову несумісність. З допомогою методу злиття клітин отримано гібриди різних видів рослин: картоплі, томатів і тютюну; тютюну і картоплі; рапсу і турнепсу; тютюну і беладонни. На основі гібридів культурних і диких видів створюють нові сорти сільськогосподарських рослин.

Виділяють 3 напрями створення нових технологій на основі культивування клітин і тканин рослин:

1. одержання промисловим шляхом цінних біологічно активних речовин рослинного походження (токсини, регулятори росту, алкалоїди, стероїди, терпеноїди);
2. використання тканинних і клітинних культур для швидкого мікроклонального розмноження й оздоровлення рослин;
1. технології, пов'язані з генетичними маніпуляціями на тканинах, клітинах, ізольованих протопластах. 
   КУЛЬТУРИ КЛІТИН ВИЩИХ РОСЛИН

Окремі клітини культивують для одержання клонів, вивчення їх генетичної і фізіологічної мінливості або стабільності. Культивування окремих клітин дозволяє вивчати умови, що стимулюють поділ клітин, ізольованих від впливу інших клітин тканини.

Вирощування ізольованих клітин складається з двох етапів:

1. ізолювання непошкодженої клітини (обробка тканин ферментами);
2. створення умов, сприятливих для росту окремих клітин.

Рослинні клітини, на відміну від тваринних, менш вимогливі до умов культивування. Перевагою рослинних клітин є їх тотипотентність - з однієї клітини може бути регенерована ціла рослина. Культура рослинних клітин дозволяє одержувати численні популяції за короткий термін.

Розрізняють 2 типи рослинних клітин, що культивуються: нормальні (каллусна тканина) і пухлинні, що ростуть і діляться на поживному середовищі без додавання фітогормонів.

Основним типом рослинних клітин, що вирощуються в культурі, є каллус. Каллусна тканина утворюється шляхом проліферації дедиференційованих клітин органів рослини. У природі каллусна тканина виникає під час травмування рослин, вона захищає місце пошкодження і накопичує поживні речовини для регенерації. Для одержання каллусних тканин фрагменти тканин різних органів рослин поміщають на штучне середовище, що містить ауксини в концентрації 0,5 - 10 мг/л. Процесу утворення каллуса передує дедиференціювання - втрата спеціалізації тканин експланта - тканина втрачає специфічну структуру, повертається до стану клітин, що діляться. Під час дедиференціювання змінюється активність генів, зникають тканино специфічні білки. Щоб запобігти зниженню здатності до поділу і росту, первинний каллус переносять на свіже поживне середовище через 28 - 30 днів.

Регенерація рослин з каллуса здійснюється двома шляхами:

• диференціація пагонів і коренів за рахунок зміни співвідношення фітогормонів (цитокінінів та ауксинів);
• утворення ембріоїдів.

Згідно з концепцією Скуга і Мурасіге утворення стебла, кореня і недиференційований ріст каллуса можна стимулювати, змінюючи концентрацію ауксинів і цитокінінів. Наприклад, за збалансованого співвідношення ауксинів і цитокінінів у тютюну спостерігається індукція утворення каллуса; за надлишку цитокінінів утворюються стеблові бруньки, а за надлишку ауксинів формуються корені.

У культурі клітина зазнає послідовних змін: втрата специфічності, ембріональний ріст, вторинна диференціація каллуса. Загальна закономірність для культивованих клітин - зростання цитогенетичної варіабельності у процесі культивування. У процесі культивування утворюються багатоядерні клітини, спостерігається поліплоїдизація в результаті порушення мітозу. Виникають зміни і на хромосомному рівні: транслокації, делеції. Для селекції генетична мінливість клітин каллуса має певний інтерес. У США із клітин каллуса одержано поліплоїдні форми тютюну.

 

2. КЛІТИННА СЕЛЕКЦІЯ

Клітини в культурі in vitro відрізняються за морфологією, біохімічними властивостями, фізіологічним станом, генетично. Це явище дістало назву амоклональної варіабельності. Генетична природа і механізм виникнення самоклональної варіабельності малодосліджені. Гетерогенність культури клітин зумовлена генетичною і модифікаційною мінливістю. Мутації відбуваються на генному, хромосомному і геномному рівнях. Клітини різного рівня плоїдності відрізняються за швидкістю поділу і росту, при цьому один із типів клітин стає домінуючим, здійснюється клітинна селекція. Модифікаційні зміни клітин у культурі мають адаптивний характер, забезпечують фізіологічну адаптацію. Спонтанне утворення різних варіантних форм клітин у культурі можна використовувати для покращання існуючих сортів сільськогосподарських культур. Практичне значення має створення форм рослин, стійких до несприятливої дії чинників зовнішнього середовища: низькі температури, засолення ґрунтів, забруднення довкілля токсичними речовинами, дія шкідників. Застосування клітинних технологій значно прискорює процес селекції.

Для прискорення селекції в культурі клітин використовують хімічні і фізичні мутагени. Найчастіше для підвищення частоти мутацій у соматичних клітинах використовують такі мутагени: нітрозогуанідин, нітрозометилсечовина, метилметансульфонат. Рідше застосовують опромінення ультрафіолетом і нейтронами. Як селективні агенти використовуються антибіотики, інгібітори синтезу нуклеїнових кислот, аналоги пуринових і піримідинових азотистих основ, фітотоксини, аналоги амінокислот, речовини, що зумовлюють водний і сольовий стреси.

Як об'єкти у клітинній селекції в умовах in vitro можна використовувати каллусні культури та ізольовані протопласти, культури соматичних або андрогенних ембріоїдів, культури ізольованих зародків, органоїдні експланти (сегменти листків, стебел).

Переваги методу клітинної селекції іп уіїго порівняно із селекцією на рівні цілих рослин:

• мутантні ознаки на рівні окремих клітин проявляються досить швидко;
• можна одержувати нові типи мутацій, у тому числі біохімічного характеру;
• економія площі: у чашці Петрі діаметром 10 см можна культивувати

7 8

10 - 10 клітин, а для такої ж кількості рослин необхідно понад 1000 га землі;

• економія часу і праці під час одержання бажаної ознаки.

Здійснення селекції на клітинному рівні дозволяє створювати нові

форми рослин у 2 - 4 рази швидше порівняно із традиційними способами селекції. Наприклад, процес створення нових сортів з використанням клітинної селекції триває у середньому 3 - 4 роки, а під час селекції на рівні рослин - 10 - 12 років. Основною вимогою для успішного застосування клітинної селекції є ефективна система регенерації рослин.

 

3. КУЛЬТУРИ ГАПЛОЇДНИХ КЛІТИН

Культури гаплоїдних клітин широко застосовуються у селекції. З гаплоїдних клітин одержують гаплоїдні рослини, що мають набір хромосом, характерний для гамет. Гомозиготні рослини використовуються для дослідження взаємодії генів, вивчення генетичної мінливості, кількісного генетичного аналізу. У таких рослин проявляються всі мутації, оскільки рецесивні мутації не маскуються домінантними алелями. Гомозиготні рослини позбавлені летальних або сублетальних мутацій.

За рахунок поліплоїдизації за дії колхіцину з гаплоїдів можна одержати гомозиготні диплоїди, які забезпечують прояв ознаки протягом багатьох поколінь. Гомозиготні лінії використовуються в селекції на гетерозис.

Гаплоїди одержують двома способами:

1. культивування іп уіїго: із незапліднених статевих клітин з редукованим набором хромосом можна регенерувати цілі рослини. Одержані при цьому гаплоїди стерильні;
2. віддалена гібридизація (в зиготі гібрида хромосоми одного з видів елімінують).

Гаплоїди вищих рослин одержують переважно із клітин спорогенної тканини пиляків (гаметофіт). Уперше гаплоїдні рослини одержано у 1964 р. індійськими вченими С. Гуха і С. Махешварі під час культивування пиляків дурману. Відтоді одержано більш ніж 200 видів гаплоїдних рослин, у тому числі пшениці, ячменю, жита, рису, картоплі. До 1984 р. у Китаї з клітин пиляків вирощено 40 видів рослин, у тому числі виведено короткостеблові і високоврожайні сорти рису.

За віддаленої гібридизації деяких видів встановлено явище селективної елімінації хромосом на ранній стадії розвитку гібридного зародка. Так, у процесі схрещення диплоїдних ячменів Иогдеиш уиїдаге (культурний) і Ногдеиш ЬиІЬозит (дикий) відбувається випадання хромосоми дикого виду й утворюється гаплоїд з набором хромосом культурного виду. За допомогою цього методу створено сорти ячменю Істок та Одеський'115.

 

КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН

Об’єктом культури in vitro можуть бути різні тканини, взяті із різних частин рослини. Найчастіше в ізольованій культурі вирощують прокамбіальні тканини, що містять первинний і вторинний камбій, судинну паренхіму коренеплодів і бульб. Останнім часом особливого значення набуло культивування тканин лікарських рослин (серед них раувольфія, діхроа, женьшень, діоскорея).

При культивуванні рослинних тканин перевага надається тканинам стебла і це не випадково: тканини стебла легко утворюють калюс, крім цього з них значно легше отримати стерильну культуру. Крім того тканини кореня, бульб, цибулин більш інфіковані, і отримати з них стерильну культуру складніше.

Культура експлантатів корене- і бульбоплодів і серцевини стебла використовується для дослідження індукції клітинних поділів і первинних етапів диференціації. У цьому випадку клітини, які перебувають на кінцевій стадії диференціації, під впливом ауксинів та цитокінінів в умовах культури in vitro переходять в дедиференційований стан і поновляють меристематичну активність. А у дедиференціаційованих тканин можна викликати диференціацію на рівні гістогенезу та органогенезу.

Експлантати серцевини тютюну. Для індукції клітинних поділів у серцевинній паренхімі тютюну потрібні і ауксин, і цитокінін. Тому цю тканину використовують для визначення ролі кожного із гормонів в індукуванні поділів. У культурі тканини, отриманої із серцевини паренхіми тютюну, можна індукувати утворення меристем стеблового апекса і отримати рослини-регенеранти. Тобто, експлантати серцевини тютюну можна використовувати для вивчення метаболізму клітини при проходженні нею циклу від спеціалізованої тканини стебла до тканини стебла рослини-регенеранта.

Крім цього, експлантати серцевини стебла тютюну використовують для дослідження в них індукції елементів провідної системи – трахей.

Ріст експлантатів, взятих із різних ділянок стебла, сильно відрізняється. Тому для вичленення експлантатів серцевини стебла тютюну використовують друге або третє міжвузля. Рослини тютюну повинні бути у фазі бутонізації – до цвітіння.

Експлантати культивують на твердому або рідкому середовищі, дотримуючись умов фізіологічної полярності – апікальним кінцем вниз.