Культури рослинних тканин та клітин

Експлантати бульб і коренеплодів. Для роботи відбирають здорові, не пошкоджені шкідниками коренеплоди і бульби. Однорідність клітинного складу, синхронність поділу, чітка відповідь на вплив індукторів поділу роблять експлантати бульб і коренеплодів зручною системою для вивчення метаболізму клітини при проходженні нею клітинного циклу і переходу із диференційованого стану в дедиференційований. Цю модель використовують для вивчення індукції синтезу ДНК, білка і різних форм РНК, дослідження ферментативної активності в різні фази клітинного циклу. Бульби топінамбура складаються із сильно вакуолізованих клітин запасаючої паренхіми. При посадці експлантатів бульби на середовище з ауксином (2,4–Д або ІОК) індукуються клітинні поділи з досить високим рівнем синхронності, так як клітини бульби топінамбура, що перебувають у стані спокою, знаходяться в G1–фазі і при поміщенні в умови in vitro синхронно проходять послідуючі фази клітинного циклу.

Інтенсивність росту шматочка тканини на живильному середовищі залежить від індивідуальних особливостей бульби або кореня і звичайно варіює між коренями навіть в межах одного сорту. Ріст тканини залежить також від положення експлантата по довжині коренеплоду: звичайно, тканини, які вичленені із верхньої третини коренеплоду, ростуть краще.

Експлантати культивують на твердому або рідкому середовищах. Щодо фізіологічної полярності, то експлантати коренеплодів моркви поміщають на середовище апікальною стороною донизу. В той же час для експлантатів бульб топінамбура або картоплі дотримання умов полярності не обов’язкове, а для того, щоб повністю виключити її вплив, можна поміщати експлантат на середовище тангентально. Хоча є думка, що дотримання умов полярності залежить від розмірів експлантатів: для досить великих експлантатів – важливо дотримуватись умов полярності, а для дуже маленьких – не обов’язково.

Культура тканин пагонів деревних порід використовується в основному для прискореного розмноження. Для цього використовують калюсні і клітинні культури. Особливого значення цей метод має для хвойних порід, а також тих деревних, які важко вкорінюються і прищіплюються звичайним способом.

Перед введенням в культуру пагони спочатку стерилізують. Встановлено, що зберігання пагонів довжиною 10–20 см впродовж кількох днів перед посадкою загорнутими у вологу ганчірку у холодильнику знижує пошкодження тканин пагона стерилізуючими речовинами в результаті закупорювання провідних елементів підсихаючим соком.

Для отримання калюсу з хорошим ростом краще використовувати молодші частини пагона або пагони молодих рослин. У деяких випадках (наприклад у Coffea sp.) здатність утворювати калюси властива лише молодим зеленим пагонам.

Утворення калюсу, хоч і в різній мірі, відмічено у всіх тканин пагона (камбію, лубу, деревини, серцевини). Дослідники спостерігали проліферацію високо спеціалізованих клітин смоляних ходів при культивуванні фрагментів із 3–5 річних гілок 14 видів сосни.

Однак найчастіше використовують фрагменти стебла, які містять камбій, що обумовлене високим вмістом ендогенних цитокінінів у таких експлантатах, і їх високою регенераційною здатністю. Камбіальні експлантати деяких видів деревних рослин можуть утворювати калюс не тільки на середовищі без цитокінінів, але ауксинів, вітамінів та амінокислот. Калюсоутворення на середовищі, що містить тільки мінеральні солі і вуглеводи (сахарозу або глюкозу) спостерігали на фрагментах пагонів каштана (Castanea) і берези, на середовищі без ауксинів – у пагонів плюща і маслини.

Встановлено, що інтенсивність калюсоутворення у пагонів деревних залежить від сезону. На експлантатах каштана калюсоутворення інтенсивніше відбувається весною, у сосни – на експлантатах ізольованих літом, у персика – в травні, червні. У листопадних порід максимальну проліферацію у фрагментів виявлено протягом жовтня – травня, тоді як процес калюсоутворення на експлантатах вічнозелених рослин мало змінювався протягом року.

Калюс камбіального походження ряду сортів і видів яблуні і вишні утворюється незалежно від пори року, тоді як розвиток паренхімного калюсу пов’язаний з сезоном.

Основний напрямок досліджень в області культури тканин деревних – це вивчення впливу різних факторів середовища на калюсоутворення та індукцію морфогенезу у цих калюсів. Для утворення калюсу на експлантатах пагонів деревних рослин у більшості випадків потрібні підвищені концентрації ауксинів – 2,4–Д, НОК, ІОК (2–10 мг/л). Здатність до калюсоутворення різна у різних тканин одного виду, а також різних видів. Сама низька регенераційна здатність у хвойних.

Індукція морфогенезу залежить від певного співвідношення ауксинів і цитокінінів, досить часто використовують суміш кінетину і БАП. Але шляхом морфогенезу у калюсній або суспензійній культурах отримано незначну кількість рослин-регенерантів листяних порід, а для хвойних порід такі відомості відсутні.

Для розмноження тих видів деревних, із тканин пагонів яких не вдається регенерувати рослин, доцільно використовувати експлантати із інших органів (пилок, зародки, проростки, меристеми).

КУЛЬТУРА КАЛЮСНИХ ТКАНИН

Калюс – тканина, що виникла в результаті неорганізованої проліферації клітин органів рослин.

У природі калюс утворюється в результаті дедиференціації паренхімних клітин у відповідь на поранення. Утворення і ріст калюсу регулюються ауксинами і цитокінінами. За допомогою цих речовин можна індукувати утворення калюсу у тих тканин рослини, які не утворюють його у відповідь на поранення. Існують нові уявлення, згідно яких не ауксини і цитокініни, а полісахариди та якісь інші індуктори викликають ділення клітин, в результаті якого утворюється калюс.

Перехід клітини in vitro із диференційованого стану до дедиференціації і активних клітинних поділів обумовлений зміною активності генів (епігенетичною мінливістю). Активування одних генів і репресування інших приводить до зміни білкового складу клітин. В калюсних клітинах з’являються специфічні білки і водночас зникають або зменшуються в кількості білки, які характерні для фотосинтезуючих клітин листка.

При переході дедиференційованої клітини до неорганізованого анархічного розмноження, яке приводить до утворення калюсної тканини, в клітинах відбуваються біохімічні і цитологічні зміни. Дедиференціація починається з використання запасних речовин і руйнування спеціалізованих клітинних органел. Через 6-12 год після індукції дедиференціації клітинна стінка розпушується і розбухає, збільшується кількість вільних рибосом, зростає кількість елементів апарату Гольджі, збільшуються розміри і кількість ядерець. Всі ці зміни передують початку поділів, які починаються через 48-72 год.

Після індукування утворення калюсу в асептичних умовах  його відділяють і поміщають на поверхню агарового живильного середовища. В результаті цього отримують стерильну калюсну культуру або тканину, яка є основним типом рослинної тканини, що культивується. Вперше калюс був отриманий із кореня моркви Р.Готре у 1938 році.

На сьогодні калюсні культури індукуються практично із будь-якого органа і тканини рослин (листків, стебел, коренів, квітконосів, частин квітки) і навіть таких спеціалізованих тканин рослин, як ендосперм насіння або мікроспори ізольовані із пиляків. Однак простота цього процесу залежить від виду рослини і тканини. Здатність утворювати калюс в умовах in vitro у молодих, ювенільних, рослин вища, ніж у зрілих. У випадку спеціалізованих тканин, наприклад ендосперму, утворення і ріст калюсу залежать від віку насіння. Як правило, калюс погано утворюється на експлантатах старших 8-11 діб після запилення. Відрізки стебла деревних рослин звичайно є поганими експлантатами для отримання калюсу.

Варто зазначити, що для успішної ініціації первинного калюсу в живильне середовище часто необхідно додавати антиоксиданти (глютатіон – 5 мг/л, діетилдитіокарбамат – 5, цистеїн – 5, аскорбінову кислоту – 5, полівінілпіролідон – 250-500 мг/л та інші), які будуть інгібувати ферменти, що окислюють феноли. Продукти окислення фенолів токсичні і пригнічують поділ клітин експлантата.

При отриманні первинного калюсу експлантати краще культивувати на кількох середовищах з різним співвідношенням ауксинів:цитокінінів (табл. 4). Успіх отримання калюсу у значній мірі залежить від підбору регуляторів росту, індукторів клітинного поділу.

Із ауксинів найчастіше використовують 2,4–Д або ІОК, яка має меншу активність. Для індукування калюсогенезу співвідношення ауксинів до цитокінінів у живильному середовищі повинно бути 10:1.

Для отримання калюсу клітини спеціалізованих тканин при поміщенні на живильне середовище повинні дедиференціюватися. У більшості випадків клітини переходять до спеціалізації із фази G1, яка передує S-фазі – фазі синтезу ДНК, рідше із фази G2. Досить часто експлантат, який використовують для отримання калюсу, містить тканини, клітини яких по різному диференційовані. Різне тканинне походження первинних калюсних клітин є однією з причин гетерогенності калюсної тканини, так як деякі функціональні особливості диференційованих клітин передаються у ряді клітинних поколінь, як стійкі модифікації. Однорідність вихідної тканини має особливе значення для злаків.

У дводольних рослин калюси легко утворюються на експлантатах різних органів: із насіння, що проростає в асептичних умовах, сегментів стебла і коренів, ізольованих фрагментів паренхіми бульб, ізольованої серцевини стебла, із листка, органів квітки, зародків, плодів і т.д.

Для отримання калюсу голонасінних доцільно використовувати, як вихідний матеріал, бруньки, які ростуть, стерильні проростки, фрагменти флоеми. Калюси злаків отримують із зародків, мезокотилів, коренів або відрізків основи стебла. Основна проблема отримання калюсу злаків пов’язана із складністю виділення із цих рослин експлантату, який складається із однорідної тканини і має оптимальний, достатній розмір. Перша калюсна культура злакових отримана із ендосперму кукурудзи у 1949 році.

На сьогодні розроблені умови отримання калюсу ряду злакових культур. Так, калюс жита отримали із ізольованого кореня, калюс ячменю – із зародка, а суспензійну культуру – із відрізків кореня проростків, калюс риса – із вузлів стебла, відрізків коренів, пагонів, вівса – із насіння, що проростає, пшениці – із сім’ядольних вузлів і зародка.

Основною особливістю середовищ для калюсогенезу у злаків і подальшого культивування калюсу є високий вміст ауксинів, найчастіше 2,4–Д (до 10 мг/л). ІОК звичайно використовують у вищій концентрації, ніж її синтетичний аналог.

Оптимальна концентрація ІОК для злаків досягає 100 мг/л. Виключенням є калюс ендосперму кукурудзи, який росте на середовищі без ауксинів, так як здатний їх синтезувати.

Процес калюсоутворення залежить від розмірів експлантата – звичайно це 5–10 мм3. Для багатьох експлантатів обов’язково дотримуватись фізіологічної полярності.

Калюси можна вирощувати дуже довго. Для цього необхідно кожні 3-4 тижні пересаджувати частину утворених клітин на свіже живильне середовище. “Найстарішим” вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре ще у 1938 році, який і сьогодні вирощують у багатьох лабораторіях світу.

У циклі вирощування калюсні клітини після ряду поділів проходять звичайний для рослинної клітини онтогенез, вони переходять до росту розтягуванням, потім диференціюються як зрілі калюсні клітини і нарешті відмирають.

Калюсна тканина представляє аморфну масу тонкостінних паренхімних клітин. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим, червоним.

Залежно від походження і умов вирощування калюсні тканини бувають:

1) пухкими, сильно оводненими, розсипчастими;

2) середньої щільності, або  компактними із меристематичними  зонами;

3) щільними.

Консистенція калюсу залежить, в значній мірі, від складу середовища: на середовищах з ауксинами, особливо з 2,4–Д, калюси стають пухкішими. Із пухких калюсів дуже легко отримати суспензійну культуру при поміщенні їх у рідке середовище. Із компактних калюсів можна отримати пухкі, але не навпаки. Найбільша здатність до морфогенезу характерна для компактних калюсів, які повільно ростуть.

Пухкі і щільні калюси відрізняються анатомічно: щільні калюси менш диференційовані, містять багато вакуолізованих клітин, які щільно упаковані. Крім цього у щільних калюсів загальна кількість полісахаридів клітинної стінки вища, але вміст целюлози порівнюючи з пектиновими речовинами і геміцелюлозами занижений.

Калюсні тканини використовують для збереження у ростучому стані колекцій різних штамів, ліній, мутантів, із них отримують клітинні суспензії, які культивують в рідкому живильному середовищі, для регенерації рослин.

Особливості калюсних клітин

Калюсні клітини in vitro зберігають багато фізіолого-біохімічних властивих нормальним клітинам, які входять до складу рослинного організму. Калюсні клітини зберігають здатність до синтезу вторинних метаболітів. Калюсам, які отримані від морозостійких рослин, притаманні морозостійкість і здатність до загартування. Такої властивості не мають калюси і тканини тропічних і субтропічних рослин. Отже, стійкість до низьких температур зберігається при переході клітини до калюсного росту.

Спільним у калюсних і нормальних клітин також є стійкість до дії високих температур, осмотично активних речовин, засолення.

Поряд з тим калюсні клітини можуть набувати деяких властивостей, які відрізняють їх від материнських. У них з’являються специфічні білки і зменшується кількість білків, які властиві фотосинтезуючим клітинам листка, або вони зовсім зникають. Калюсні клітини відрізняються значною генетичною гетерогенністю та фізіологічною асинхронністю.

В результаті виходу з під контролю організму калюсні клітини ростуть неорганізовано і асинхронно.