Культури рослинних тканин та клітин

Клітинний цикл калюсних клітин довший, ніж у материнських клітин. Особливістю калюсних клітин є гетерогенність за віком. В калюсній тканині одночасно присутні клітини молоді в G1-фазі, старі в G2- і S-фазах циклу.

Значні відмінності спостерігаються в енергетичному обміні калюсних клітин. Вони споживають менше кисню у порівнянні з нормальними. Дихальний коефіцієнт калюсних клітин більший 1, що свідчить про зсув співвідношення між диханням і бродінням в бік посилення бродіння. Мітохондрії в калюсних клітинах розвинуті слабо, у них мало крист, що не може не впливати на активність аеробного дихання.

В калюсних клітинах спостерігається зсув в сторону пентозофосфатного шляху, який є джерелом пентоз, необхідних для клітин, що діляться.

 

Генетика калюсних клітин

Тривалий час вважали, що калюсні клітини генетично однорідні. Однак в 60-х роках ХХ ст. було виявлено, що калюсні тканини мають виражену генетичну гетерогенність.

Однією з причин генетичної нестабільності клітин, що культивуються in vitro може бути генетична неоднорідність вихідного матеріалу (гетерогенність експлантата). У багатьох рослин диференційовані тканини містять клітини різної плоїдності. Другою причиною може бути тривале культивування культур in vitro, яке призводить до накопичення в них генетичних змін, в тому числі до нерівномірної зміни плоїдності. Порушення кореляційних зв’язків при ізолюванні ділянок тканин рослин і поміщення їх на штучне живильне середовище теж призводить до генетичної нестабільності клітин. Подібні результати можуть бути обумовлені впливом на генетичний апарат клітини фітогормонів, які входять до складу живильних середовищ. Найактивнішим мутагеном є 2,4-Д, яка є складовою більшості живильних середовищ. Цитокініни, зокрема кінетин, сприяють поліплоїдизації клітин.

Генетичне різноманіття калюсних клітин дозволяє використовувати їх для клітинної селекції на стійкість до несприятливих факторів середовища, фітопатогенів і на підвищену продуктивність.

 

КУЛЬТУРА КЛІТИННИХ СУСПЕНЗІЙ

Культура клітинних суспензій або суспензійна культура – вирощування окремих або невеликих агрегатів у завислому (суспендованому) стані в рідкому середовищі при використанні апаратури, яка забезпечує їх аерацію і перемішування.

Суспензійна культура використовується для вивчення фізіологічних закономірностей росту, диференціації, метаболізму соматичних клітин вищих рослин. Особливе значення має  використання біосинтетичного потенціалу рослинних клітин для промислового отримання при великомасштабному культивуванні ряду економічно цінних речовин – алкалоїдів, стероїдних сполук, глюкозидів, ефірних олій, ферментів тощо.

Клітинну суспензію отримують з шматочка калюсу в рідкому середовищі, яке перемішується. Для ініціації суспензійної культури необхідно 2-3 г свіжої калюсної маси на 60-100 мл рідкого живильного середовища. Первинну суспензію отримують на коловому шейкері зі швидкістю перемішування 100-120 об/хв.

Суспензійну культуру можна отримати також із фрагмента органа рослини (листок, стебло, корінь). Спочатку на поверхні експлантата утворюється первинний калюс, а потім від нього відділяються клітини і клітинні агрегати, які дають початок клітинній суспензії.

Для отримання високо диспергованої суспензійної  культури велике значення має тип вихідної калюсної тканини. Оптимальною є калюсна тканина пухкого типу, яка легко розсипається при внесенні в рідке середовище, що перемішується. Для цього калюс вирощують на середовищі з високою концентрацією ауксинів і зменшеною концентрацією або без цитокінінів і без іонів Са2+. Додавання в середовище фермента пектинази, який руйнує пектат кальцію, що склеює окремі клітини, полегшує отримання суспензії.

Необхідною умовою культивування клітинних суспензій є постійне перемішування середовища. Якщо клітинна суспензія перебуває в нерухомому стані, то ділення суспензійних клітин призводить до утворення калюсної тканини.

Первинну суспензійну культуру перед субкультивуванням фільтрують через 1-2 шари марлі, нейлонові або металічні сита, щоб позбутися від великих і щільних шматків калюсної тканини і крупних агрегатів.

Для глибинного культивування рослинних клітин користуються способами вирощування, які розроблені в мікробіології. Використовують закриті або відкриті системи в періодичному або протоковому режимах.

У закритій системі при періодичному режимі вирощування клітинна маса поміщається в певний об’єм середовища. До закінчення вирощування система залишається закритою за всіма параметрами окрім газів.

У закритій безперервній культурі у систему періодично подається свіже живильне середовище, а старе видаляється у тому ж об’ємі. Клітини залишаються в системі протягом всього періоду вирощування.

У відкриті протокові культури періодично поступає свіже середовище, однак відбирається не лише старе середовище, а й частина клітинної маси. Регуляція цього процесу може здійснюватися за принципом турбідостата або хемостата. У турбідостаті подача свіжого середовища і відбір суспензії відбуваються після досягнення клітинною суспензією певної заданої густини. Сигнал на включення поступає від реле, яке зв’язане з оптичною системою, що визначає густину суспензії. В хемостаті швидкість протоку задається експериментатором і від неї залежить швидкість росту клітинної маси. Режим хемостата дозволяє за допомогою фіксованої швидкості розбавлення підтримувати постійну швидкість поділу і густину клітин у популяції. Найпоширенішим режимом культивування клітинних суспензій є закрита періодична система. У цьому випадку для аерації і перемішування суспензії використовують різну апаратуру: ролери, шейкери (як правило колові), ферментери з механічними і магнітними змішувачами або ферментери барботажного типу, в яких аерація і перемішування здійснюється повітряним потоком.

Для роботи з суспензіями необхідно знати їхні характеристики: життєздатність, щільність клітин в суспензійній культурі, ступінь агрегованості, швидкість росту.

Життєздатність клітин визначають за їхнім забарвленням барвником (метиленова синь або синь Еванса). Живі клітини не фарбуються барвником так, як клітинні мембрани непроникні для нього. В мертві клітини фарба легко проникає, і вони забарвлюються у синій колір.

Одним із основних показників, які характеризують стан клітинної суспензії, є щільність клітинної популяції. Кількість клітин визначають в лічильній камері Фукс-Розенталя під мікроскопом після мацерації хромовою кислотою (10-20 %).

Звичайно пасаж культивування клітинної суспензії становить 14-16 днів. За цей час щільність зростає від 5·104 до 5·106 кл/мл.

Якість суспензії залежить від ступеня агрегованості її клітин. Агрегати не повинні  містити більше 10-12 клітин. Для видалення крупних агрегатів суспензії фільтрують через марлеві, нейлонові або металеві фільтри. Водночас це дозволяє позбутися від залишків експлантата або щільних шматків калюсної тканини.

 

Культивування ізольованих клітин

Для генетичних і фізіологічних досліджень, а також для практичного використання в клітинній селекції використовують ізольовані клітини. Отримання клону-потомства одиночної клітини допомагає з’ясувати причини генетичної неоднорідності калюсних клітин, оскільки спостереження в цьому випадку проводяться на тканині, яку отримали не з гетерогенного експлантата, а з однієї клітини. Ізольовані клітини також використовують як модель для вивчення взаємовідношень між клітиною і оточуючим середовищем, клітинами рослини-хазяїна і різними патогенними мікроорганізмами тощо.

Отримання одноклітинних клонів рослин складається з двох етапів:

1. виділення одиночних  життєздатних клітин;

2. створення сприятливих  умов для їх поділу і росту.

Для виділення життєздатних культур використовують такі методи:

1. вирощування калюсної маси і отримання із неї суспензії;

2. слабо агреговані суспензії;

3. виділення окремих клітин  із тканин цілої рослини.

Отримання клітин із суспензійних культур пов’язане з меншим ризиком пошкодження порівняно з виділенням безпосередньо із органів рослини. Для отримання одноклітинної фракції суспензійної культури іноді достатньо простого відстоювання у колбі протягом 15-30 хв. При цьому крупні агрегати осідають на дно колби, а надосадова фракція містить тільки одинокі клітини або дрібні агрегати. Якщо при відстоюванні не вдається отримати одноклітинну фракцію, то застосовують ферменти для мацерації, центрифугування в градієнті сахарози або фільтрування через сита (нейлонові або металеві).

Труднощі культивування одиночних клітин пов’язані з тим, що окрема клітина не ділиться в тих умовах, в яких добре росте калюсна тканина. Для того, щоб змусити одиночні клітини ділитися, розроблені спеціальні методи:

1. метод культури  “няньки”;

2. метод мікрокультури або висячих крапель;

3. метод плейтінга.

Сюди можна віднести і культуру ізольованих протопластів, яку буде розглянуто далі.

Метод культури “няньки” запропонував Джонсон у 1960 році. Функцію “няньки”, яка стимулює поділ одиночної клітини, виконують шматочки калюсної тканини, відокремлені від неї фільтрувальним папером. У присутності “няньки” одиночна клітина ділиться і дає індивідуальну колонію клітин – клон (Рис. 2).

Метод мікрокультури базується на використанні дуже малих об’ємів багатого живильного середовища і являє собою культивування одиночних клітин в мікрокраплі в чашці Купрака об’ємом 20 мл. Метод запропонував

 

 

Рис.2. Метод культури “няньки” для вирощування культури із одиночної клітини.

 

академік Глєба Ю.Ю. У мікрокраплях зручно спостерігати за отриманням і діленням клітин при соматичній гібридизації.

Метод плейтінга передбачає змішування клітин суспензії з розплавленим та охолодженим до 35°–40° С середовищем і розлив тонким шаром (1 мм) у чашки Петрі. Цей метод був розроблений Бергманом у 1960 році. Цей метод використовують для отримання одноклітинних клонів та оцінки життєздатності клітин.

Використання культури “няньки”, мінімального об’єму середовища, в якому культивується окрема клітина, пов’язані з феноменом, який називають “дія фактора кондиціонування”. Незважаючи на численні спроби визначити хімічну природу речовин (або речовини), які індукують ділення одиночної клітини, і механізм дії фактора кондиціонування, ця проблема залишається не вирішеною. Дослідження показали, що цей фактор хімічної природи і включає низькомолекулярні речовини (~700 Д).

 

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ: