Лекции по "Биотехнология"

3.Микрокөбейту  процесінің кезеңдері.

 Өсімдіктердің вегетативтік  көбеюінің жаңа келешегі бар  тәсілі болады, ол генетикалық  біртекті, сауыққан, егетін материалды  алуға, өсудің жоғары коэффициентіне  ие болуға, селекциялық үдерісті қысқартуға, жыл бойына жұмыс жасауға мүмкіндік береді, оның үстіне өсімдіктерді өсіру үшін керекті алаңды үнемдейді. Әдіс жоғары сапалы егетін материалды алуға көмектеседі., оны қолдану егін шығымын әжептәуір көтереді және оның сапасын жақсартады.

а) клоналдық  микрокөбейтудің кезеңдері 

Бірінші кезең – өсімдік донарды таңдау эксплантты бөліп алу және зарарсыздау, in vitro жағдайында қоректік ортада оның өсуіне жағдай жасау(32-сурет). Жұмыстың табысты болуы, донорлы өсімдіктің өсуі мен дамуының жағдайларын ескеріп, эксплантты дұрыс таңдауға байланысты.

    Екінші кезең- микроөсірудің өзінің  жолы:

     А)  экспланттың барлық қолтық бүршіктерінің  дамуын белсендіру нәтижесінде  бастапқы және де жаңадан пайда  болған өркендердің апикалдық басымдылығын басу;

     Б)  апикалдық басымдылықты сақтаған  өркендердің микроқалемшеленуі;

     В)  жапырақтық, сабақ тіндерімен (буылтықтық  қабыршақтары мен түбіртегімен), тамырсабақпен, гүл шоғырларының  өсінділеріменадвентивтік бүршіктер  түзілуін белсендіру. Бұл кезеңде мериклондардың жиналуына қол жеткізу қажет, мұнда субкүту артқан сайын қалыптан ауытқыған морфологиялы өсімдік-регенеранттар көбейетінін және өсімдік-мутанттар түзілу мүмкіндігін еске алу керек.

Үшінші  кезең – көбейген өркендердің  тамырлануы және in vitro жағдайларына пробиркалық өсімдіктердің бейімделуі.

     Қалыпты  тамыр жүйесінің дамуын қамтамасыз  ету қажет. Бұл үшін қоректік  ортаға  лизогендік себепкер шарт  – ауксидерді қосады. Тамырлар  пайда болғаннан кейін өсімдіктерді  топыраққа өсуге дайындайды, не төменгі температурада сақтауға қояды (депомдау). Бұл өсімдіктердің дамуын тоқтатады және оларды ұзақ уақыт сақтауға мүмкіндік береді, кейін керек уақытында пайдалана береді.

Төртінші  кезең – топырақта немесе жасанды  субтратта жылыжай жағдайында күту ыдыстардан алынған өсімдіктерді өсіру.

     Іске асыруға немесе жерге егуге дайындық. Ауаның ылғалдылығын жоғарылатады және жарықтану қарқынын арттырады. Өсімдіктер гетеротрофтық қоректенуден автротрофтыққа ауысады.

    Пробиркалық  өсімдіктерді егу үшін ең қолайлы уақыт – көктем немесе жаздың басталу кезеңі. Екі-үш жапырақтармен жақсы дамыған тамыр жүйесі мен өсімдіктерді ұзын ұшты пинцеттермен колбалар немесе пробиркалардан сақтықпен алады. Тамырларды агар қалдықтарынан жуып алады және алдын ала 1-2 сағ  бойы 80-90⁰С-та зарарсыздандырылған топыырақтық субстратқа отырғызады.

9 билет

1.Өсімдіктердің клондық микрокөбейуіне әсер ететін факторлар.

Андрогенездің тікелей жолы – эмбриогенез, ал андрогенездің  жанама жолы – каллусогенез. Көбінесе, өсіп шыққан өсімдіктер гаплоидты хромосома санымен болады. Гаплоидтар ұрықсыз болады, себебі гомологиялық хромосомалары болмағандықтан мейоз процесі бұзылып, аномальдық хромосомалар жиынтығы бар гаметалар түзіледі. Сол себептен дигаплоидты материал алу үшін бұл өсімдіктердің белгілі даму кезеңінде хромосомаларды колхицинмен екі еселендіреді. Тозаңқаптағы мыңдаған микроспоралардың ішінде тек қана кейбіреулері ғана эмбриодтарды түзеді. Бұл құбылыс генетикалық деңгейде белгіленуі ықтимал. Андрогенезге бірнеше факторлар әсер етеді. Андрогенезде негізгі бастапқы факторлар:

1. өсімдіктің  дамуы кезеңі.

2. қоректік  орта компонентерінің әсері.

3. өсіру жағдайлары (физикалық-химиялық факторлар, яғни  жарық, температура, ауаның ылғалдығы,  колхицинмен өңдеу тәртібі) болып  табылады. Академик І.Рақымбаевтың ғылыми жетекшілігімен арпаның ұзақ уақыт бойынша өсірген андрогендік құрылымдарынан оқтын-оқтын регенерант өсімдіктерді шығару әдісі жете зерттеліп дайындалған.

2.Клондық  микрокөбейту әдісін қолдану  және оның болашағы.

In vitro дақылы әдісінің тамыры ХІХ ғасырға барып тіреледі. 
Габерландт (Haberlandt, 1902) алғаш рет тканьдер дақылы әдісін өсімдікті пайдаланды.   
Гаррисонның (Harrison, 1907), Картелдің (Carrel, 1911) және Барроустың (Burrows) Осыны ескере отырып, бірқатар зерттеушілер өсімдік клеткаларын өсіру үмітсіз деп. Сөйтіп қуаттау ортасы мен техникасының құрамын жетілдіру өсімдік объектісін алды. Алайда, бұдан ары қарай өсімдік ткандері үшін қуаттау жағдайы болды.Оқшауланған тамырлар дақылын Н.Г. Холодный 1915 жылдың өзінде бастаған. Отызыншы жылдары өсімдік ткандерінің дақылы әдісі өзінің қазіргі сипатында. Готренің негізгі еңбегі in vitro-ны әртүрлі органдардың ткандерін көптеген зерттеулерінде қолданды. Біздің елімізде ткандер дақылы бойынша жұмыстар жүйелі түрде 1944 
Алпысыншы жылдарға дейін меристем дақылы әдісін пайдалану зерттеу лабораториясы Іn vitro-ны көбейту идеясы осылайша пайда болды, басқаша айтқанда, өсімдіктер клеткасы, ткандері және органдары культурасы әдісі қазіргі кезде қолданылады. Өсімдік ткандерінің культурасы – биологияның практикамен тығыз байланысты. Қазіргі заманғы ғылым ұсынатын құралдар өсімдік клеткаларының биологиясының организмнен ерекшеленеді. 
Құлпынайды микрокөбейту саласындағы жетекші маман профессор Pr. Boxus (Бельгия). Біздің елде in vitro жағдайында клоналды көбею әдісін табысты жүруде. Қазіргі кезде құлпынайдың вируссыз клондарының коллекциясына 20 сорт түрі бар. Жеміс дақылдарына қолдануға болатын микрокөбейту тәсілін Г.А. Курсаковтың қара өрікті гибридтеуде қол жеткізген табыстары болды. СССР ҒА Өсімдіктер физиологиясы институтында алпысыншы жылдардың өзінде басталды. Осылайша, қазіргі кезде өсімдік клеткаларын, ткандерді және органдарды өсірудің микрокөбейту болады.Микрокөбейтудің өсімдіктерді дәстүрлі вегативті көбейту тәсіліне қарағанда негізгі артықшылықтары болды. - көбеюдің жоғары коэффициенті. /1980/ былайша саналды: егер І эксплантат 5 жаңа өскін. - құнды материалды инфекциялар «банкі» көзінен қорғауды құру. - аймақтар мен елдер арасында өсімдік материалын кеңінен алмасу. Алынған in vitro өсімдігі көрсетілген көбейту әдісі арқылы жасартуға болады. Әдістің ірі мүмкіндіктері мен келешегі зор. 
Өсімдік клетка керемет ерекшелігімен айрықшаланады (тұтас организмді қалпына келтіруге болады). Соңғы кезде пайда болған гендерді мутациялау (мутагенез) процесін жүргізеді. 

3.Жасанды  тұқым.

Тотипотенттік жасушалардың ядролары эмбрионнан энуклеирленген аналық жасушаларға көшіру жолымен  эмбриондарды клондауданжинақталған  тәжірибе сомалық жасушалардың ядроларын  энуклеирленген аналық жасушаларға көшіру жолымен жануарларды клондау әдісін әзірлеу үшін негіз болған. Эмбрионалдық жасушалардың ядроларын көшіру жолымен клондаудың қағидалық айырмашылығы тек өзара бірдей жануарларды алуды ғана емес, сондай генотип бойынша донор жануармен ұқсас сомалық жасушаларды алуды қамтамасыз етуінде. 1993-1997 жылдары Рослин институтында Я.Уилмунт бастаған бір топ зерттеушілер доноры эмбрионалды жасуша дақылы болып табылатын 5 бірдей ұқсас қой клоны алынды. Жасушалық дақылды келесі жолмен: 9 күндік қой эмбрионынан микрохирургиялық жолмен эмбрионалді дискіні бөліп алып, көптеген пассаж бойы жасушаны in vitro жағдайында дақылдады. Бұл жасуша дақылы TNT4 деп аталды. Фенотипі бойынша алынған қозылар TNT4 жасушалық линиясынан шыққан қой түріне ұқсас болды. Осы әдісті пайдаланып, алғаш рет 1997 жылы Долли атты қойды клондады. Бұл генетикалық сараптамада дәлелденді.

10 билет

1.Өсімдіктерді сауықтыру.

Танаптық  және жеміс-көкөніс дақылдарын сауықтыру  үшін термоөңдеу, меристеманы өсіру  және вирустық тест арқасында сұрыптау тәсілдері аралас қосыла қолданылады. Өсімдіктер биологиясы және биотехнология институтының б.ғ.к. С.В. Кушнаренко жетекшілігімен көптеген шаруашылыққа бағалы өсімдіктердің биотехнологиялық клондау әдістері жасалында және олардан әр түрлі вирустан сауыққан көшеттер алынды. Оларға әсемдік өсімдіктер (раушан, фрезия, қалампыр, орхидея), жеміс-жидектер (алма, алмұрт, қара қарақат, қой бүлдірген, таңқұрай, өрік), дәрі-дәрмекке жататын (қызыл мия, стахис, цикламен), техникалық өсімдіктер (қант қызылшасы, құрқұма, сабында тамыр) жатады. Институтының Микроклондық көбейту зертханасында және Өсімдіктер физиологиясы және биохимия зертханасында б.ғ.к. В.К. Мурсалиеваның және профессор Б.Ә. Сәрсембаевтің жетекшілігімен бағалы дәрі-дәрмек өсімдіктер – стахис пен стевияның дәрілік шикізат алу биотехнологиясы жасалынды. Осы зерттеудің негізінде диабетке қарсы емдік-профилактикалық препарат алу мүмкіншілігі дәлелденді. Стахис пен стевияның биологиялық өсіп дамуын жан-жақты зерттеудің негізінде Қазақстанның климатикалық жағдайда өсіру үшін, оның өнімділігін арттыруға үйлесімді әдістермен әртүрлі ұтымды жолдарын жасауға ұсыныстар жасалынды.

2.Апикальдық  меристеманы өсіру.

Вирустар  қоздыратын аурулармен күресудің негізгі  жолы, ол аурудан таза, сауықтырылғн көшет алу. Биотехнологиялық әдістерді қолданып вирустан тазартылған өсімдіктерді алу үшін апикалдық меристеманы өсіру әдісі қолданылады. Апикалдық меристеманы өсіру әдісі – өсу конусының ең жоғары ұшынан бір немесе екі алғашқы жапырақ бастамасы бар оқшауланған бөлігін залалсыздандырылған қоректік ортада өсіру әдісі. Бұл тәсіл вегетативтік жолмен, яғни жыныссыз жолмен көбейетін өсімдіктергеқолайлы болып келеді. Апекс – өсу конусының ең жоғары ұшыны. Апикальдық меристеманы өсіру әдісімен бірге термоөңдеуді, хемотерапияны және вирустарды сарапқа салуды табысты қолданылады. Егерде апекс бөлініп алынатын өсімдікті жылумен өңдесе, вирустың көбеюі тоқтап, өсіп шыққан өркеннің ұшында вирус болмайды. Ал сол меристемадан өіп шыққан регенерант вирустан таза болады. 

3.Вирус жұққан өсімдіктерді айқындау.

Жылумен өңдегенде  өсіп келе жатқан өркен ұштарында  вирустың көбею күшті тежеледі, сондықтан  жаңадан пайда болған меристема  клеткаларында вирустың болмауы  мүмкін. Жылумен өңдеу нәтижелі болу үшін донорлық өсімдіктерді жоғары температурада (34-40°С) өсуге жақсы жағдай жасап ұзағырақ ұстау қажет. Вирустардың 34-45°С температурасында көбеюінің тежелуі зат алмасудың өзгеруімен байланысты. Сол кезде жаңадан өсіп шыққан өркендердің ұштары вирустан таза болады. Бірақ барлық өсімдіктер ұзақ мерзімді жылумен өңдеуге шыдамайды. Олардың өсуі бәсең келеді және басқа да жағымсыз өзгерістер байқалады. Өсімдіктердің түріне байланысты және вирустың түріне қарай эксплантты 7 күннен 7 аптаға дейін жылумен өңдейді. Сонымен қатар эксплант вирустарды тежейтін, бірақ өсімдіктердің өсу қарқынын арттыратын заттармен өңделеді. Танаптық және жеміс-көкөніс дақылдарын сауықтыру үшін термоөңдеу, меристеманы өсіру және вирустық тест арқасында сұрыптау тәсілдері аралас қосыла қолданылады.

11.билет

1.Қартоптың  вируссыз көшетін алу

Қартоптың вирусы жоқ  көшет материалын алу технологиясы түйнектерді жылумен өңдеуден басталады.Вирустардың 34-40 t  көбеюінің тежелуі зат  алмасудың өзгеруімен байланысты.Түйнектерді  вирустың түріне қарай 7 куннен 7 аптаға дейін жылумен өңдейді.Меристемаларды бөліп алу үшін ақшыл,ұзындығы 3-5 см өскіндер пайдаланады.Өскіндерді жуып щайып,стирильдеп,бокстың ішінде олардың апекстерін бөліп алады.Іс жүзінде 50-100 онымен  бірге алғашқы жапырақ бастамалары алынады,сонда оның көлемі  500 мкм жетеді.Осыған бола экспаланттың ішінде вирустары болуы мүмкін,бірақ оның есесіне апекстің өсуге қабілеті  артады.Апекстер агарланған қоректік ортада өсіп дамиды.Ұзындығы 0,3-0,5 см өркендер пайда болған соң,оларды одан да жаксы өсу және тамырлану үшін жаңа қоректік ортаға көшіреді.5-7 жапырағы шыққан соң,өсімдіктерді қалемшелеп,әрқайсысын құрамы бұрынғыдай қоректік ортаға пробиркаларға отырғызады.Бір қалемшені вируска терксеру үшін алып қалады.Вирусы жоқ өсімдіктер сауықтырылған линияның негізін салады.Вирустардан тазартылған өсімдіктерді көбейуін жылдамдату үшін оларды жүйелі микроқалемшелйді.Қалемшелерден өсімдіктер меристемамен салыстырғанда едәуір тез дамиды.сонымен бірге тамырлары мықты және жапырақтары мол болады.Пробиркаларда микроқалемшелеу арқасында 2-3 айдық ішінде 2-3 мың өсімдік алуға болады.Меристемалық өсімдіктердітиімді пайдалану мақсатымен қартопты микротүйнектерменкөбейтудің жылдамдатқан әдісінің технологиясыдайындалған.соңғы кезде картопты сауықтыру үшінкаллауыстардыпайдаланады.Каллауысты қайта-қайта жаңа ортаға көшіргенде,оныңклеткалары вирустардан тазартады,морфогенез процестері нәтижесінде вирустары жоқ регенерант өсімдіктері шығады.Дәлелденгендей кейбір сорттарды сауықтыру үшін осы әдіс апикальдік меристеманы өсіруге  қарағанда тиімді келеді.Өсімдіктің ұшынан алынған каплустарында морфогенез процестері тез өтеді.Вирустардан таза материалдарды алу табысты болуы мына шарттарға байланысты:

1.өсімдікті жылумен  өңдеу мүмкіншілігі;

2.Меристеманы өсіру  мүмкіншілігі

3.Вирустарды анықтайтын  жаксы игерілген сезімталдығы жоғары тесттың болуы;

4.Сауықтырылған материалды  толық оңашалау жағдайында өсіріп  көбеййту

5.Сауықтырылған материалдың   мөлшері жыл сайын алғашқы   материалды жаңартуға жеткілікті  болу керек

Бұл шарттар түрлі  дақылдарда бірдей орындала алмайды.қазіргі  кезде осы әдіспен картоптың бағалы сорттарының барлығы дерлік сауықтырылған,бірақ біздің елімізде бұл технология алғашқы тұқым шаруашылығына енгізілмеген.

2.in vitro ұрықтандыру. 

in vitro жағдайында тозаңды,тұқым бүршіктерін және түйіндерді өсіру әдістерінің жетілуі арқасында тозаң мен ұрықталмаған тұқым бүршігін бірге өсіріп прогамдық сыйымсыздықты жеңетін жолы табылады. in vitro жағдайында өткізетін тозаңдандыру мынадай кедергілерден өтуге мүмкіншілік туғызады.1.тозаңның аналық мойынның жоғарғы бөлігінде өсе алмауы;2.тозаң түтіктерінің өте ұзын аналық мойын аркылы тұқым бұршікке жете алмауы;3. тозаң түтіктерінің өте баяу өсуі немесе олардың аналық мойында жарылып кетуі.Тұқым бүршікті in vitro өсіргенде  ұрықтанудың мүмкіншілігі аналық мойында алып тастаса,арта түседі.Тозаңдандырудан бастап будан тұқым өсіп шыққанша барлық  процестер in vitro жағдайында өтеді.Бұл салада  үнді ғалымдарының қосқан үлесі зор.алғаш болып 1958 ж эмбриолог С.Мехешвари көкнәрдің ұрықтанған тұқым бұршігін in vitro жжағдайында өсіріп,одан пісіп жетілген тұқым алған.Сосын ол көкнәр мен темекінің бүрбүртігі бар және бүрьүртігі жоқ тұқым бүршіктерін in vitro тозаңдандыру әдісін жете зерттеп дайындады.

in vitro ұрықтандыру әдісі генетика мен селекцияның теориялық мәселелерін шешуден басқа,тозаңның және ұрықтандырудың физиологиясын зерттеу үшін қолданылады.

3.Эндосперімді  in vitro өсіру

Эндосперімді  in vitro өсіру  үшін алғащқы әрекеттер 1930 шы ж жасалған,бірақ  көпкешейін олардан еш нәтиже шықпаған.Бірінші  болып 1949 ж Ла Ру жүгерінің пісіп жетілмеген әндосперімін тұқымнан жеке бөліп алып табысты өсіреді,бірақ ол жалғыз ғана регенерант өсімдігін ала алады.Эндосперм клеткалары үш плоидтық болады.егер эндоспермді in vitro өсіріп ,оның клеткаларының  регенерант өсімдік алса,ол үшплоидтық болып шығады.Селекция үшін үшплоидтық өсімдіктердің маңызы зор.Оларды дағдылы жолмен алу өте қиынға соғады.Бір өсімдіктің жетілген немесе пісіп жетілмеген эндоспермдерін өсіру үшін әр түрлі органикалық заттар қосыылған ортаны талап етеді.Эндоспермді осіріп үшплойдтық өсімдіктерцитрустарды,алмадан,күріштен,сандал ағашынан алынған.Сонымен,эндоспермді өсіру әдісін пайдалану аркылы азық түлікті дақылдардың селекциясын тиімді жүргізуге болады.