3. Индукцияланған
мутагенез
In vitro өсірілетін өсімдік
клеткалары мутагенез механизмдерн
зеттеу үшін жәен құнды мутанттарды алу үшін өте бағалы
экспериментальдық жүйе болып табылады.Мутацияларды
жиі-жиі алу үшін түрткі боларлық әртүрлі
заттаремн немесе әрқилы жағдайлармен
әсер етуге ,яғни индукциялауға тырысады.Ең
тиімді мутагендер болып рентген және
ультракүлгін сәулелері , нитрозометилмочевина
,метилметансульфонат,этионин т,б саналыдддды.Қоректік
ортаға қосылған кейбр ауыр металда мутагендік
әсер етеді. In vitro өсірген клеткаларды
қолданғанда қоерктік ортаны азғантай
көлемінің өзінде мииондаған,тіпті милиард
клеркалармен істеуге мүмкіндік туады.Клеткалық
селекцияның артықшылығы,ол клеткаларды
біркелкі жәе бақылаулы жағдайда мутагендермен
өңдеу және лоарды тез сұрыптаушы жағдайында
өсір мүкіншіліг.Осылай өзгертілген клеткалардан
кейін жаңа қасиеттері бар яғни мутант
өсімдіктерді шығаруға болады.Мутагендер
төзімді клеткалар клондарының шығуын
артырады.Мыс,темекі клеткаларына N-нитрозо-N-метилмочевинамен
әсер еткенде пайда болған мутация арқасында
олардың Nacl төзімділігі асқан.Бірақ
мутагендер кедейсоқ мутацияларды тғызып,қажетті
белгілердің пайда болуымен қатар зиян
мутацияларды да қоздыруы мүмкін.Сондаай-ақ
мутант клеткаларын алу үшін гаплойдтық
клеткалар ретінде микроспораларды қолдануға
болады.Сөйтіп,мутагенезбен клеткалық
селекция өсімдіктердің сомалық және
жыныс клеткаларын in vitro өсіргенде ,генетикалық
өзгертілген өсмдік формалары мен жаңа
сорттарын шығарудың тиімді жолдар болып
табылады.
19-билет
1.Сомаклондық
өзгергіштіктің себептері
Сомактолндық өзгергіштік-бірегей
құдылыс бұндай өзгерстері бар өсімдіктерді қазіргі таңда ешбір басқа
жолымен алуға мүмкін емес.Өсірілетін
клеткалардағы қандай да болсын өзгергіштікті
тек хромосомалар саның өзгеруімен ,кейде
хромосомалардың құрамындағы өзгерістермен
,нүктелік мутациялармен ,цитоплазмалық
гендердің өзгерістерімен байланыты деп
соңғы кездерге дейін есептеліп келеді.Клетка
деңгейінде өтетін өзгерістерді тек спонтандық
мутация деп түсінуге болмайды,себебі
сомаклондық өзгерістер спондандық мутациялардың
жиіоігінен шамасы 1000 есе артық кездеседі.Самоклондық
өзгергіштік өте күрделі құбылыс ,оны
тек осы себептер нәтижесінде өтеді деп
түсну жеткіліксіз.Молекулалық генетиканың
соңғы мәлеметтер бойынша ,эукариот клеткасында
генетикалық материалдың ұйымдасуы қаншаам
күрделі болса ,in vitro өсірілген клеткаларда
өтетін өзгергіштік процестерді түсіну
де соншама қиын.Сомаклондық өзгергіштікті
жан-жақты зерттеген австралиялық ғалым
У.Скаурофт пікірі бойнша,оның себептері
кариотиптік өзгергіштіке, хромосомалқ
аберрацияларда, гендердің амплификациясында
немесе рдукциясында,жылжымалы генетикалық
элементтердің ауыспалылығында,дифференцировкамен
байланысты гендер құрамындғы өзгерістерде
жәнесомалық кроссингверде.Хромосомалар
құрылысындағы өзгерістер тұқым қуалайтын
өзгерістерінің кең және көп түорлі классы,ол
генетикалық материалдың бір бөлігініңжойылуын,ек
іеселенін ауыспалығы 180 –ге айналуы бір
хромосома ішінде немесе бірнеше хромосомалар
арасында өтуін камтиды.Өсірілген ұлпаларда
росомалық аберациялар өте жиі кездеседі,сондықтан
олардың елеулі фенотиптік өзгерітерге
әкеліп соғуы әбден мүмкін.Бірақ регенерант
өсімдіктер мен олардың ұрпақтары арасында
хромосомалықабберациялар сирек кездесед,себебі
даму кезінде олар элиминацияға ұшырайд.Мысалы:
регенеранттарда морфогенезге тиым салынатын
хромосомалық аберрацияларкездеспейді.Сонымен
қатар,сомаклондық варианттардың ұрпақтарында
ұрықсыздыққа апаратын хромосомалық аберрациялар
да болмайды.
2. Бактерия
пламидалары және рекомбинананттық
ДНҚ молекуласын құрстыру
Векторлар ретінде
көбінесе ішек таяқшасы E coli және
де басқа бактериялардың плазмидалары қолданылады.Бактерияларда
басты хромосомадан басқа көптеген кішкентай
сақина тәрізді болып тұйықталған қо тізбекті
ДНҚ молеклалары кездеседі.Олар бірнеше
мың нуклеотидтерде тұрады,плазмидарлар
деп аталады.Сақина сияқты ДНҚ молекулалары
бір-ірен оралып күрдео спираль құрайды.Пладмидалар
өз бетіне реплкациялана алатын ДНҚ молекулалары
.Олар бактериянң басты хромосомасымен
тіркеспеген,клетка ішінде өзалдына еркін
орналасқан плазмида құрамында тетракиклин
немесе канамицин антибиотиктерге төтеп
беруді қамтамасыз ететін ферменнтер
гендері бар.Плазмидомаларды хромосомалы
ДҢҚ –нан бөлеше таза алуға болады.Құрылымдық
генді векторға тіркеп қосқанда рекомбинаттық
ДНҚ пайда болады.Ол үшін плазмиданы және
кере гені бар ДНҚ –ның бөлшегін рест-риктазамен
жіп сиқты кеседі.Олардың ұштары бір тізбекті
немесе мұқал басты болады.Мұқал және
қысқа бір тізбекті ұштард трансфераза
ферментіні көмегімен бірнеше аденинді
неесе бірнеше тимидинді жалғап ұзартады.Сонда
құрылымды геннің бір ұшы А-А-А-А, ал екінш
ұшы Т-Т-Т-Т плазмиданың жіп сияқты болған
молекласны да екі ұщы сондай болады.Сөйтіп,А-Т
комплементарлы болгандықтан,рестрикцияланған
фрагменттерде жабысқан ұштр пайда болады.Оларда
кейін ДНҚ лигазасымен бір-біріне жабыстырып
қосып,бұдан рекомбинанттық Дңқ жасалды.Оны
клоундап көбейту үшін бактери клеткасына
енгізедіПлазмиданың бір ерекшелігі ол
бір бактерияның клеткасынан келесі клеткаға
оңай ене береді.Бактерияның ішінде олар
репликацияланып көбейе бастайды.Сонымен
, бөтен ДНҚ-ның транскрипциясыда трансилиациясыда
бітеді.Сөйтіп бөтен гендер жазлыған белок
синтезделеді,яғни клетка трансформацияланады.
3. Гендерді
тасымалдайтын векторлар
Құрылымдық гендерде
тек қана метобализм өтудің
нәтижесінде түзілетін заттардың
(белоктың,Ирнқ-ның коды жазылған)оларда
ген активтілігін реттейтін бөлшек мүлдем
жоқ.Сондықтан жаңа құрылымдық гендерді
иеленген клеткааларда ол гендер өз бетімен
тиісті қызметн атқара ламайды.Гендердің
клеткадағы әрекетін басқаратын репликация
және таркскрипция сигналдарын оларға
вектор қамтамасыз етеді.Бөтен генді клетка
ішіне тасымалдап алып баратын арнаулы
ДНҚ молекуласын вектор дейдй.Оған мынадай
талаптар қойылады:1)өз алдына репликациялану
,яғни клетка ішіне бөтен генді алып кірген
соң клеткамен бірге немесе өз алдына
көбейе алатын болуы керек:немесе вектор
клетка хромосмасының құрамына еніп ,онымен
брге ұзақ клеткаадарға беріліп отыруы
кере;2)трансформацияланған клеткадарды
анықтау үшін оның ерекше генетикалық
белгілері маркерлері болуы керек мыс;антибиотикке
төзімділігі;3)құрамында рестриктазалар
үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы
керек және репликацияға қабілетін жоғалтпау
керек;4)векторға орналастырған бөтен
ген оның атқаратын қызметін бұзбау керек,ал
вектор болса,олда енгізілген геннің ішінде
дұрсыреттеліп жұмысістеуін қамтамасыз
ететні болуы керек,5)вектордың көлемі
кішігірім болуы керек.Әдетте ,құрылымдық
ген өте қысқа болып келеді(бірнеше жүз
нуклеотид).Оны бірден көп мөлшеде бөліп
алу қиын.Сондықтан оынң көшірмелерін(молекулаларының
санын)жетерліктей көбейту керек.Генді
клондау үшін бактерияалр қолданылады.Мыс,өте
жақсы тексерілген зияны жоқ ,кең таралған
бактерия –ішек таяқшасы e.coli.Керект ген
орналастырған векторды бактерияға енгізеді.Бактерия
тез бөлентіндіктен , онңы ішіндегі векторда,генде
бактериямен бірге көбейеді.Ақырында
өскен бактерия биомассаысан вектор мен
ген,яғни рекомбинаттық ДНҚ көп мөлщерде
бөлініп алынады.
20-билет
1.Сомаклондық
өзгергіштікке әсер ететін факторлар
In vitro өсіру
кезінде пайда болатын өзгергіштіктың
молдығына донорлық өсімдіктің
генотипі әсер етеді.Мыс, арапынң хромосомалық аномониялары
,бидайдың таңқурадың,бегинияның морфологиялық
өзгергіштерінің жиілігі түрлі сорттарында
әр қилы болған.Күріште өзгерістің пада
болу жиілігімен олардығ олардың әртүрлігі
өсіру жағадйына емес сорт табиғатына
байланысты болған.Сомаклондық өзгергіштіктің
пайда болуы сондай-ақ қоректің ортаның
құрамына да байланысты ,әсіресе фитогормондарға
.Гормондар құрамының өзгеруі клетка циклыың
кинетикасыен мтоздың өзінің де клеткаларының
регенераттарда өзгеруіне әкеліп соғады.Клеткалард
бүтін өсімдіктен бөліп алып ,жасанды
қоерктік ортада өсірудің өзі лардың гормондық
баансы өзгертеді.Ұлпаның өсіру мерзіснің
ұзақтығы хромосомалық аберрацияларды
көбейте түседі.Сондықтан кллустан алынған
сомаклондық варианттардың жиілілігі
каллусты өсру мерзімі сизылғанына қарай
арта түседі.Мыс, арпада цитогенетикалық
анамальдық өсымбіктерлің пайда болу
жиілілігі ұлпаларды өсіру мерзісмен
байланысты болған.Бұл анамалияоар хромосомалардың
үзілуін жоғалуын ,алмастырылуын және
анеуполойдияны камтиды .Сомаклондық
өзгергіштікті зерттеу теория тұрғысынан
генетикалық өзгергіштіктің механизмдерін
түсіну үшін маңызды.Ал,пратикалық жағынан
,өсірілетін клеткаларды өсімдік селекциясында
кеңіен қолдану үшн қажет.Сомаклондық
өзгергіштіктің селекция үшін маңызы
ол өсімдіктердің жаңа формаларын будандастыруды
қолданбай-ақ генетикалық әр алллуандықты
молайту мүмкіншілігі.Шаруашылықтың маыңзыд
белгілері бар күріштің ,бидайдың,жүгерінң
қант қамысынң жоңышқаның кортоптың рапстың
зығырды,темекінің сомаклондық варианттары
алынған.Сомаклондық варианттарды негізінде
апесимен шабдалының жаңа сорттары шығарылған.
2.Гендік инженерия
Гендік инженерия-млекулалық
және клеткалық генетикаынң қолданбалы
саласы .Белгілі қасиеттері бар
генетикалық материалдрды (гендерді)
in vitro жағдайында ладын-ала құрастырып,оларды
тірі келткаға енгізіп,көбейтіп,зат алмасу
процесін өзгеше жүргізу.Бұл әдіспен организмдердегі
генетикалық информацияны көздеген мақсатқа
сай өзгертіп ,оладың геномдарын белгіленген
жоапармен қайта құруға болады.Гендік
инженерия ол функциональдық активті
генетикалқы құрылымдарды рекоьинаттық
будан ДНҚ молекулалары түрінде қолдан
құрастыру .Гендік инженерияның мәне жеке
гендерді бір организмен алып басқа организмге
көшіріп орналастыру. Бұған рестриктазамен
лигаза ферменттерінің ашылуы мүмкіндік
туғызады.Рестриктазалар ДНҚ молекуласын
белгілі жерлерден жеке үзінділерге қиып
бөлшкетейтін ыдыратушы фермент.Казір
ДНҚ молекуласын бір-біріенөзгеше 120 жерінен
үзетін 500-ден астам рестрикталар анықталған.Алынған
полинуклеотид бөлшкетрінің комплементарлық
немесе жабсықыш ұщтарын ДНҚ лигазасы
бір-біріне желімдеп реттеп жалғастырып
қосады.Осы ферменттердің көмегімен бір
ДНқ молекласына қажетті ген бөлініп алынып
басқа ДНҚ молекулсының үзіндлермен құрастырылып
рекомбинаттық,яғни жаңа будан ДНҚ жасалАДЫ.Одан
кейін рекомбинаттық ДНҚ бірнеше әдістермен
тірі клеткаларға енгізледі.Жаңа геннің
экспрессиясы өтеді де клетка сол ген
белглеітін белкты синтездей батайды.Сонымен,клеткаға
рекомбинанттық ДНҚ молекуласы түрінде
жаңа генетикалық информацияны енгізіп,ақырында
жаңа белгісі бар организмд алуға болады.Бұндай
органимзмді трансгендік немес трансформацияланған
оргнизм деп атайды,себебі бір организмнін
өзгеріп басқа қасиетке ие болуын трансформация
дейді.
3. Жылжымалы
генетикалық элементтерді вектор ретінде қолдану
Жылжымалы генетикаылқ
элементтер транспозондр ,секіргіш,көшпел
ігендер-ДНҚ құрамынд болатын
және өзіндік құрылымы мен
генетикалық қасиеттер жағынан
ерекшеліктері бар нкулеотид
тізбектерінде орналсақан гендер
тобы,олардың клетка геномында орын ауыстыруға қаблеті өте
мол.Жүгері дәндерінің түрлі түсі болуыны
генетикалық негіздерін зерттеп тәжибелер
жүогізу нәтижеснде транспозпондарды
алғашқы ашқан Нобель сыйлығының жүлдегері
Брбара Мак-Клинток 1950жыл.Ол бұларды реттеуші
элементтер деп атады.Бұл жылжымалы генетикалық
элементтер қасындағы көршілес гендердің
экспрессиясын реттейді.Олардың хромосомада
белгілі тиянақты орны болмайды.Геномның
әр жеріне ажырап шығып,басқа қандай болса
сондай,кездейсоқ жері етіркесе береді.Жылжымалы
элементтер өз орындарын бр хромосома
бойында ғана мес кейде басқа хромосомағада
көшіп ауыстырады.Олар ажыраған соң жаныдағы
бұрын жұмыс істемей тұраған гендер активтенеді.Ал
реттеуші элементтермен қосылған гендер
тұрақсыз,мутацияға жиі ұшырайтын болады.Қызіргі
уақытта жылжымалы генетикалық элементтердің
көптеген прокариотық және эукариоттық
организмде болғаны анықталған.Шамасы,олар
барлық тіршілік иесін тән шығар.Бактрерияларда
жылжымалы гендердің ұзындығы мен құрылымы
жағынан айырмашылығ бар екі негізгі класы
анықталған;1) инцерциялық тізбектернемесе
is-элементтері ,ұзындығы 1000-дай нклеотидтер
жұбы құрамында ауыпалыққа жауапты тек
бір ғана гені бар.Ұзынығы 3-20 мнж ,құрамында
әртүрлі улы заттарға бактериялардың
төзімді болуын қамтамасыз ететін бірнеше
қосымша гендері бар.
Билет № 21
1.Вирустарды
вектор ретінде қолдану.
Клетканың вируспен
немесе зақымдануы, онда жаңа генетикалық
материалдың пайда болуына әкеп
соқтырады. Әдетте вирустар репликацияланған
кезде олардың генетикалық материалдарының
өте көп көшірмелері түзіледі. Сондықтан, вирустар
мен вироидтар бөтен геннің жаөсы тасымалдануын,
хромосомаға тіркесуін және эксперссиясын
қамтамасыз ете алады.
Вирустардың
бөтен нуклеин қышқылдарын өздеріне
жабыстырып, тасымалдап алып жүретін
мүмкіншіліктері мол. Бірақ вирустарды вектор ретінде
қолданудың екі кемшілігі бар: олар ауру
қоздырады және қожа клетка геномына тіркесе
алмайды. Ал вегетативтік жолмен көбейетін
өсімдіктерге бұның кедергісі болмайды.
Вирусты вектор ретінде қолдану үшін оның
патогендік қабілетін әлсірету немесе
мүлдем жою қажет. Сонда ол өсімдікке зиян
келтірмейді. Осындай әлсіз вирус шаммдары
кейде табиғатта өз бетімен пайда болады
немесе тәжірибеде мутагенез арқылы алынады.
Вектор
ретінде өсімдік вирустарының
үш түрін қолдануға болады: 1. сыңартізбекті РНҚ-сы бар; 2. сыңартізбекті
ДНҚ-сы бар; 3. қостізбекті ДНҚ-сы бар.
Өсімдік
вирустарының бәрінің дерлік
генетикалық материалы сыңартізбекті
РНҚ-дан тұрады, яғни мРНҚ-дан.
Және де олар жұқпалы ауру
туғызады.
Вирустарды
вектор ретінде қолданудың артықшылығы, ол вирустан
алынған ДНҚ-ны өсімдік жапырағына жаққанның
өзінде-ақ оларды клеткаға кіргізу мүмкіндігі.
Одан кейін вирус өз бетімен көбейіп, клеткалар
бөлінген сайын бүкіл өсімдікке ауру жұқтырады.
Вироидтар
- өте ұсақ, сақина тәрізді дөңгеленіп оралған молекулалық
салмағы жеңіл сыңартізбекті РНҚ жіпшесі.
Қазір 15 –ке жуық вироидтар анықталған.
Олардың РНҚ құрамына 240-380 нуклеотид кіреді.
Вирустардан айырмашылығы, вироидтар
белок қабығымен қоршалмаған, өте қысқа
дара РНҚ молекуласы. Олардың репликациялану
механизмдері белгісіз. Вироидтарда ДНҚ
түзілу стадиясы жоқ сондықтан тікелей
орналаса алмайды.
2.Гендерді
өсімдіктерге тасымалдау әдістері.
Генетикалық
материалды клеткаларға енгізу әдістері
әжептеуір көп, атап айтқанда:
1. клеткаларды агробактерияларымен
бірге өсіру.
2. протопласттарға
ДНҚ-ны ПЭГ және Са2+ көмегімен енгізу.
3. ДНҚ-ны липосомаларға
салып тасмалдау
4. электропорация
5. микроинъекция
6. электрофорез
7. баллистикалық
әдісі
8. «жапырақ
бөлшігі» әдісі.
Қосжарнақты өсімдіктерге агробактериялардың
ауру жұқтыруы табиғатта кең таралған
құбылыс. Практикада өсімдік клеткаларының
трансформациясын ин витро өткізген қолайлы.
Трансформацияланған кейбір өсімдітердің
ұрпақтары алынған. Оларға бөтен ген енгізу
арқасында пайда болған жаңа қасиеттер
Мендель заңы бойынша тұқым қуалайды.
Вируленттік агробактериаларды протопласттармен
аралас бірге өсіргенде трансформация
өту үшін клетка қабығының қайта құрылыуы
қажет. Бұл құбылыс клетка қабығының түзүлуін
тежейтін заттарды қолдану және бактериялардың
протопласттарға қосылуын тежейтін ЭДТА
қолдану арқылы дәлелденген.
Протопласттарға
ПЭГ және Са2+ көмегімен Т-ДНҚ-ны
тікелей енгізу тәжірибелері жасалған.
Трансформацияланған клеткалар гормондар
жок ортада өсіріліп сұрыпталған.
«Жалаңаш» ДНҚ протопласттарға
тасмалданғанда, оны қорғау үшін ДНҚ-ны
липосомаларға салады, әтпесе клеткалардағы
нуклеаза ферменттері оны ыдыратып жібереді.
Протопласттар фюзоген көмегімен липосомалармен
оңай қосылады немесе эндоцитоз арқылы
олардың ішіне сіңеді. Бұл әдіспен ДНҚ-ны
клеткаларға қай өсімдік түрі болса да
енгізуге болады.