Лекции по "Биотехнология"

Ең бірінші болып 1971 жылы Такебе протопластарды нәтижелі өсіріп,олардан өсімдіктерді шығаруға болатындығын дәлелдеді.Лайықты жағдайда протопластар клетка қабығын қайта  түзіп,кәдімгі нағыз клеткаға айналады.Электрондық  микроскоп көрсеткендей,Vicia haistana  протопластарының сыртқы қабатында10-20минут өткен соң бірінші целлюлозаның микрофибрильдері пайда болады,ал 20 сағаттан кейін олар қабықтың тығызторын түзеді.Клетка қабығының плазмалеммаменбайланысының бұзылуы,шамасы,бббірден қабықты қайта құру механизмін іске қосады.Ең қызығы,қабығынан айырылмаған плазмолизге ұшыраған протопластың үстінде жаңа қабықтың түзілгені.Қабықтың түзілуінің ерекшеліктері және жалдамдығы бастапқы клетканың түріне және дифференцировкасына байланысты.Алқа,крестгүлділер,шатыршагүлділер тұқымдастар өсімдіктерінің протопластары клетка қабығын24 сағат ішінде түзеді.24-36 сағаттан кейін клеткалар бірінші рет бөлінеді,ал 3-4 апта өткен соң каллус клеткаларының колониясы түзіледі.Өсіру кезінде біртіндеп ортаның осмостық қысымын төмендетеді,соынң нәтижесінде бөліну жылдамдығы өседі.Содан кейін каллустарды регенерация өту үшін қатты ортаға көшіреді.Каллуста морфогенездің басталуы,яғни өркен мен тамырлар түзілуі регенерант өсімдіктер пайда болуына әкеледі.Талай өсімдіктердің протопластары сомалық эмбриогенез арқылы да  регенерант өсімдіктер түзеді.Оқшауланған протопластардан пайда болған клеткалардың бөлінуге және тотипотенттілігінін жүзеге асыруға қабылеттері көптеген факторларға тәуелді: 1)бастапқы ұлпаның түр ерекшелігі,физиологиялық күйі және дифференцировкасы,яғни генетикалық және эпигенетикалық сипаттамасы: 2)протопластарды бөліп алу әдістері мен жағдайлары:3)протопластарды суспензияда өсіргендегі тығыздығы:4)қоректік ортаның құрамы: 5)протопластарды өсіру жағдайлары. Көптеген ауылшарушылығына маңызы зор өсімдіктердің жақсы өсетін,ақырында регенерант өсімдік беретін протопластары алынған.Бірақ олардың клеткаларының бөлінуін және дифференциялануын реттейтін факторлар туралымәлиметтерәлі жеткілікіз.Алқа тұқымдастарына жататын темекінің,шырайгүлдің,картоптың,томаттың протопластарынан регенерант өсімдіктер алу оп-оңай,ал ыстық тұқымдастары мен бұршақ тұқымастары үшін көпке шейін бұл өте қиын мәселе болып келді.Швед ғалымы Т.Эриксон пікірінше,мүмкін темекі мен оның тұқымдас түрлері ерекше стресстерге төзімді болғандықтан,олармен оңды нәтижеге жетуге болады.Алайда,соңғы жылдардың көптеген жұмыстардың нәтижелерінқорыта келе,ол мынадай ойға келеді.Өсімдік клетканың биологиясы жөнінде білімнің жетіспеушілігінің салдарынан ғана бұл жұмыстар сәтсіз болып жатыр,ал ғалымдардың күшін біріктіріп болашақта осы мәселені шшуге үміт бар.И.Васил бидайдан және африка тарысынан бөлініп алынған протопластардан сұйық ортада ұрықтар мен өскіндерді ала алды.

2.Жат текті  түрлерді сомалық будандастыру

Әрқилы тұқымдатар,трибалар (тұқымдас пен туыс аралығындағы жүйелеу  бірлігі) және туыстар құамына кіретін  бір-біріне жат түрлер арасында жыныстық жолмен будан алу мүмкін емес.Филигенезде  түпкі тектері алшақ жатқан түрлер арасынан тек сомалық буданды,олардың протопластарын қосып алуға болады.Бірақ осы кезге шейін ондай сомалық будандардан құнды ұрпақты өсімдіктер әлі алынған жоқ.Мысалы,ғалымдар мынадай тұқымдас аралық будан клеткалардан линиялар алғна:соя мен темекінің әр түрлерінің каллус пен мезофилл протопластарын қосып:бұршақ пен темекінің:ат бұршағы мен темекінің:темекі мен пияздың және т.с.с Осы тұқымдасаралық клеткалық будандардың клондары зерттелді.Барлығында қысқа мерзімде мезофил клеткасының  хромосомалары жойыла бастаған.Цитогенетикалық талдау мне изоферменттердің құрамын талдау көрсекендей,хромосомалар толық жойылмаған.Тұқымдасаралық будан клеткалар расында көп ядролық немесе өте кіші клеткалар,хромосомалық қайта құру,алып хромосомалар көп байқалған.Тек темекі мен ат бұршаға арасындағы будан клеткаларда морфогенез индукциялау арқасында сабаққа ұқсас кемтар құрылымдар пайда болған,яғни трибааралық және туысаралық будандармен өткізген тәжірибелердің нәтижесі жөндірек болған.Бұндай будандар алқа,крестгүлдер және шатыршагүлділер тұқымдастарында алынған.1978 жылы Ю.Ю.Глеба мен Ф.Хофман арабидопсистың каллус протопластарын турнепстың мезофил протопластарымен қосып сомалық будан алды.Бұл өсімдіктер крестгүлділер тұқымдасының әр түрлі триболарына жатады.Будан клеткалар линияларында цитолигиялық талдау көрсеткендей,екі түрдің де хромосомолары жойылмаған,дегенмен хромосомаларда қайт құру өткен.Клеткалардың екі линиясында морфогенез жүргізіліп регенерант өсімдіктері алынған.Олар морфология жағынан арабидопсискеде ,турнепскеде ұқсас болған.Бірақ бұл нормалы өсімдіктер емес еді,олар гүлдеген жоқ.Цитологиялық,биохимиялық және морфологиялқ талдау өткізгенде,будан өсімдіктерде екі түрідң де генетикалық материалы болғаны дәлелденді.Ал арабидопсис пен турнепстің in vitro жағдайында өсірілген клеткаларынан сабақтар шыққан жоқ.Бұл өте  қызық құбылыс.Будан клеткаларында морфогнез бен регенерация өткені морфогенездік қабілетінің калпына келуін дәлелдейді.Сомалық будандастыру жолымен сасықмендуана мен итжидек ( красавка ),итжидек пен қытай темекісі ,итжидек пен бежір (сныть),итжидек пен шырайгүлдің (петуня) арасында трибааралық будандар алынған.Бұл жұмыстардың маңызды нәтижесі,олар филогенезде түпкі тектері алыс өсімдектердің будан клеткалардың морфогенездік активтігін көрсетеді.Сонымен бірге морфогенезге қабілеттілік ата-аналардың біреуінің генетикалық материалының жойылуымен байланыспаған.

  3. Клеткалық селекция

In vitro өсірілген клеткалардың  арасынан нақтылы бір селективтік  жағдайжа сәйкес өзгеріске ұшырап , пайдалы қасиетке ие болған  клеткаларды көбейтіп сұрыптап алуды клеткалық селекция дейді.Әрбір клеткадан өсімдік шыға алатын болғандықтан,клеткалық селекцияны қолданып өсімдіктердің жаңа формаларын тез алуға болады.Оларға бастама болған клетка белгілі бір төтенше факторға төзімді келсе,одан шыққан өсімдікте көбінесе сол қасиетті сақтай алады. Клеткалық целекцияның артықшылығы мынада:жыл он екі ай маусымға тәуелсіздік және уақыт пен егіс көлемінің үнемделуі. In vitro өсетін клеткалық популяцияның әрбір клеткасын жеке организм деп теңесе,бір тәжірибенің өзінде-ақ миллиондаған дарақпен мыңдаған ғана өсімдіктермен жұмыс істей алады.Молекулалық және хромосомалық деңгейлердегі өзгерістері мен организм деңгейінде белгілердің өзгергіштігі арасындағы байланыстар туралы мағлұматтардың жеткіліксіздігі клеткалық селекция жөніндегі зерттеулерге үлкен кедергі келтіреді,сондықтан бұл жұмыстар көбінесе эмпирикалық жолмен жүргізіледі.

17-билет  

1.Сомалық будандарды  сұрыптап алу әдістері

Жеке гетерокариондар  мен буданпропластарды көптеген ата-аналық протопластардың арасынан сұрыптап алу қиын міндет.Сондықтан аоғашында зерттеушілердің будандарды регенеранттар пайда болғанда мутациялардың комплементарлығы негізінде іріктеген.Г.Мельхерс пен Г.Лабиб 1974 жылы алынған өсімдітерінің нағыз сомалық будан екендігін дәлелдеу үшін генетикалық комплементтенуді қолданды.Генетикалық комплементтену- ол будан клеткаларда гендер әрекеттесу негізінде ақауы бар гендердің функциясын қалпына қайтадан келтіруі.Ата-ана ретінде Nicotiana tabacum екі сортын қолданды.Олардың жарыққа сезімтал хлоропластары болған.Олардың жарыққа сезімтал хлоропластары болған.Әрбір сорттың ядросында жарыққа сезімталдықты белгілейтін өзінің рецессивтік гені болған (v мен s).Сол гендердің салдарынан бұл өсімдіктер жарықта өскен кезде хлорофилл түзілуі кемтар болған.Осы гендер бойынша гомозиготалық өсімдіктер күшті жарықта өсіргенде , жапырақтары түссізденіп ,ақырындап құрыған.Ал жыныстық будандардың хлоропластары дұрыс түзіліп,жапырақтары жасыл болған,себебі мутацияға ұшыраған ақау гендер жыныстық процесс кезінде комплементтеніп кеткен.Екі сорттың гаплоидтық протопластары қосылғанда да дәл сондай нәтижеге жеткен.Бұл тәжірибе бірнеше сатыдан тұрған.Алдымен тозаңқаптарды өсіріп гаплоидтық өсімдіктер алынған.Бұл өсімдіктер жарықта емес, көлеңкедк өсірілген.Сондықтан жапырақтары жасыл болған,сәуле түспеген соң олардың мутацияға душар болған гендері өздерінің активтігін көрсете алмаған.Протопластарды қосып,будан клеткалар жасаған.Ол клеткаларды колониялар және каллустар пайда болғанша өсірген.Каллустарды жаңа ортаға көшіріп ,морфогенез процесін жүргізген.Сонда каллустардан сабақтар шыққан.Одан соң жарықта ( 10000лк)өсіре бастаған.Бұл жағдайда хлорофилл түзіп жасыл өскіндері болып, тірі қалған тек қана сомалық будан  өсімдіктер ған.Ал будан емес өскіндер ақшыл болған,ақырында құрыған.

2. Клеткалық  селекцияның әдістері

Селекцияны қажетті  бір бағытта өткізу үшін,яғни өсіп жатқан клеткалардың арасынан белгілі  мутациялары бар жеке клеткаларды  сұрыптау үшін оларды арнайы селективтік  ортада өсірген.

Сондай жағдайда тек  мутант клеткалар ғана өсе алады.In vitro жағдайында селекцияны амин қышқылдар                                      аналогтарына,нуклеотидтераналогтарына,патотоксиндерге,антибиотиктерге,гербицидтерге,тұздар мен ауыр металлдардың жоғары концентрацияларына,төмен pH көрсеткіштері мен басқа да түрлі-түрлі факторларға төзімді клеткалық линияларды сұрыптап алу үшін жүргізеді.Сондай-ақ гормондарға,витаминдерге,амин қышқылдарына прототрофтық немесе ауксотрофтық клеткаларды сұрыптайды,яғни сол заттар ортада болмағанда немесе болғанда ғана өсе алатын клеткалар ірікткліп алынады.Егер де белгілі бір затқа төзімді клеткаларды сұрыптап алу керек болса, оларды сол зат қосылған ортаға егіп өсіреді.Ал ендінақтылы стресс факторға төзімді клеткаларды сұрыптап алу мақсаты болса, онда ішінде клеткалар өсіп жатқан ыдыстарды дәл сондай жағдай(төмен немесе жоғары температура,гипоксия,т.,с.с. ) әсер ететін жерге орналастырады.Біраз мезгілден соң клеткалардыңкөбі бөліне алмай,өсе алмай құриды,тек мутация  немесе эпигенетикалық өзгерістер арқасында сол факторға төзімділік көрсеткен ғана тірі қалады.Бұндай әдісті тура селекция деп атаайды.Осындай тәсілді кейбір метаболлиттерді(мысалы,амин қышқылын)көп мөлшерде түзіп өндіре алатын клеткаларды  алу үшін қолданады.Амин қышқылының аналогін өзінесіңірген жабайы клеткалар өледі,себебі полипептидтер дұрыс түзілмейді,белок синтезі бұзылады.Өйткені амин қышқылының орнына оның аналогі полипептидтің құрамына кіріп кетеді.Ал мутанттар сол амин қышқылын басқа клеткалардан гөрі артық түзетіндіктен оларда белок синтезі дұрыс өтеді де,ондай клеткалар тірі қалады.

3.Төзімді клеткаларды  сұрыптау

 Қажет белгісі бар  клеткаларды суспензиядан ,каллустан,протопластардан  сұрыптап алуға болады.Суспензияны  пайдаланғанның негізгі артықшылығы,стандарттық  микробиологиялық әдістерді қолдану мүмкіншілігі.Өсімдік клеткалар селекциясының көптеген тәсілдері микроорганизмдер мен жануарлар сомалық клеткаларының генетикасынан алынған.Клеткалар топтары көлемінің кішігірімдігі және олардың бірсыпыра физиологиялық гомогендігі, бірден көптеген клеткаларға селективтік фактордың әсерін тигізуге мүмкіндік береді.Көлемі 1 л ,тіпті одан да аз ортада бірнеше миллион клеткаларды тексеруге болоды.Кейде суспензиядағы клеткаларды агарланған ортаға көшіріп отырғызады.Бүндайда әрбір агардың үстінде өсіп шыққан клеткалар колониясы клон(жеке клетка ұрпағы)болу ықтималдығы болу зор. Клеткалардың немесе протопластардың жақсы суспензиясын алуға мүмкіндік болмаған кезде, агарланған қою ортада өсетін клекаларды қолдану қолайлы.Сонымен қатар,бұндай клекаларды селективтік фактор суда ерімейтін кезде де қолдануға болады.Бұл жағдайда ол зат органикалық   еріткіште еріледі де,табақшадағы агардың  үстіне тегіс жайылады немесе ерітілген ортаға қосылады.Каллус трансплантантының клеткалары бұндай ортада тежелуі затпен бірыңғай әрекеттеседі:төменгі клеткаларға жоғарыдағы клеткаларға қарағанда сол заттың мөлшері артығырақ тиеді.Төзімді клеткалар жақсы өсуінің нәтижесінде біртіндеп көріне бастайды,оларды бөлшп алып,селективтік ортаға отырғызып,тұрақты линияларды шығарады.Төземді клеткалар линияларын протопластардан сұрыптаудың өз артықшылығы бар,себебі протопластарды  суспензиядағы клеткалар мен каллустардан ғана емес ,бүтін өсімдіктерден де алуға болады.Одан басқа ,протопластарды клеткалық линия  тек қана жалғыз жеке клеткадан шыққанына сенім мол болады.

18-билет 

1.Сомалық будандарды  практикада пайдалану

Сомалық будандастыру цитология,генетикалық,молекулалық  биологиялық,физиология салаларында  теориялық мәселелерді зерттеу  үшін,сондай – ақ практикалық целекцияда қолданылдады.Сомалық будандастыру-селекция үшін өте жаңа технология.Ол жыныстық жолмен будандаса алмайтын өсімдіктердің формалары мен түрлерін будандастыруға мүмкіндік береді,яғни түр аралық гибридизация процесін шектейтін генетикалық сийымсыздықты жеңе алады.Тіпті жыныстық будандастыру мүмкін болған кездің өзінде де ,сомалық будандардын жыныстық будандардан өз артықшылықтары бар.Себебі,сомалық будандарда цитоплазмалық гендер ата-ананың екеуінен де тұқым қуалайды.Ал жыныстық будандарды цитоплазмалық гендер тек қана аналықта тұқым қуалайды. Сомалық будандарды селекция процесінде пайдалану үшін олар гүлдеуге және тұқым беруге қабілетті болулары қаажет , өйткені сорт шығару үшін бірнеше ұрпақ кері қайтара аталық немесе аналықпен будандатыруға түседі.Ұрпақсыз будандарды селекцияға пайдасы жоқ.Әдетте ,сомалық клеткалар қосылғанда, алынған буданда хромосомалар саны екі еселенеді.Вегетативтік жолмен көбейетін кейбір өсімдіктерде(картоп,қант қамысы,т.б) хромосомалардың саны өзгергендігі қауіп туғызбайды.Ал көптеген ауыл шаруашылық дақылдары жыныстық жлмен көбейетіндіктен,оларға бұндай хромосомалық өзгерістер зиян болады.Сондықтан сомалық бданның плойдтылығы өзгермеу үшін,гаплойдттық өсімдіктің протопластарын қос кере немесе сомалық бданның тозаң қкаптарын in vitro өсіріп олардан гаплойдтық өсімдік шағарып ал керек.Сомалық будандастырудығ практикалық жетістіктері Nicotiana ,Solanum ,Datura туыстар ішіндегі түр аралық будандарда шығарумен байланысты болады.Мысалы,практикалық селекция үшін бағалы темекінің кейбір жабайы түрлері шруашылыққа құнды Nicotiana tabacum сорттарымен жыныстық жолмен будандаспайды.Ал парасексуалдық будандастыру арқасында ұрпақ беруге кабілеті амфидиполйдтық өсімдіктер алынып,кейін олар селекция жұмыстарында пайдаланылады.Сасық меңдуананың өнеркәсібте қолданылатын мол алкалойдты сорттарын шығардағы селекция жұмыстарында сомалық будандар қолданылады.О.Шидер 1978 ж. сасық меңдуананың жыныстық будандасуға қабілетсіз түрлерінің протопластарын қосып,нормалы ұрық бере алатын сомалық будандарды алды,және де олардың құрамында скополамин алколойды 20-25 проценттен артық болды.

2.Төзімділік  белгісінің тұрақтылығы

Өсу процесін тежейтн  факторларға төзміді өсімдік  клеткалар линияларын сұрыптауда ең негзігі қиындық-сол белгінің тұрақсыздығы.Ол кейін сұрыптау факторы боламаған  кезде айқындалады.Бұндай тұрақсыздықтың себептері әртүрлі болуы мүмкін.Стресс фаткорының ықпалымен геномның зақымдануы реверсияларды туғызады.Реверсия немесе кері мутациялар-организмнің мутант күйінен жабайы типке кері көшуі.Немесе стресс факторныңы әсерімен пайда болған өзгеріс уақытша генетикалық немесе эпигенетикалық адаптация болғаны.Бірақ шамасы тұрақсздық көбінесе клеталық популяция құрамында жабай клеткалардың сақталып қалуына байланысты.Стресс факторы балмаған жағдайда олар тез көбейе бастайд да ,ақырында мутант клеткалардың орнын басады.Сондықтан жаңадан алнған линияларды тұрақтылығ бір қалыпқа түспегенше немесе клеткалар популяциясы тек мутант клеткаларының ұрпағы болмағанынша ,яғни жеке мутант клетканың клоны болмағанша сұрыптаушы жағдайда өсіру қажет.Төзімді және тұрақты клеткалар линияларын алу ұзаққа созылатын процесс.Клеткалар линиясы генеткалық жағынан тұрақты екендігіне көз жеткізі үшін клеткаларды 4-6 рет жаңа сұрыптауш ықоерктік ортаға көшіріп өсіреді.Мұнда тұрақтылығы модификациялық тұқым қуаламайтын өзгергіштікпен белгіленген клеткалар құрып кетеді.Бұл жағдайда сұрыптаушы ортада төзімділігі генетикалық өзгерсітер себебінен пайда болған клеткалар ғана жақсы өсе алады.Одан кейін бұл клеткаларды сұрыптаушы факторы жоқ қоректік ортаға көшіріп,тағы да 2-3 пассаж өткізеді.Содан сон оларды қайталай сұрыптауыш ортада өсіріп,бір жолата тұрақты клондарды бөліп алып,регенерант өсікдіктерді шығарады.Р.Гонзалес пен  Д.ж .Уиидхолн әрбір таңдап алынған линияны екі түрлі жағдайда өссіруді ұсыннады.Линияның бір бөлігін срыптаушы ортаға көшіріп өсіреді,екіншісін жай қоерктік ортада өсіреді.Осы линиялардың өсу қарқындығын бірнеше айлар бойы қадағалайды.Егер де жай ортада өсірілген клеткалардан қайтадан клондар алу керк.Қажетті белгісін сақтау үшін тұрақты линияларды сұрыптап алған соң оларды тез көбейтіп клондарды алу керек.Клеткалар линиясы деген бір немесе бірнеше клетканы (агрегатты) көбейту арқылы алынған клеткалар.