Западно-Казахстанский Государственный
Медицинский Университет
им. Марата Оспанова
Самостоятельная работа студента
Специальность: Общая медицина
Дисциплина: Общая иммунология
Кафедра микробиологии, вирусологии
и иммунологии
Курс: 3
Тема: «Моноклональные антитела. Гибридомная
технология. Основные области применения
МКАТ в иммунологии.»
Группа: 323 «А»
Форма выполнения: реферат
Выполнила: Мусина Д.
Проверил: Засорин Г.А.
Оценка: __________________
Роспись: __________________
Актобе – 2015
Содержание:
Введение.
1.Моноклональные антитела. Общие свойства
моноклональных антител.
2.Гибридомная
технология.
3. Получение
моноклональных антител. Этапы
получения монАТ
-Иммунизация.
-Гибридизация В-лимфоцита с клеткой
миеломы.
- Культивирование клеток.
-Скрининг супернатантов гибридом.
-Клонирование гибридом.
-Наработка гибридомных клеток и секретируемых
ими антител.
-Хранение клеток.
4.Основные области применения
мкат в иммунологии.
Заключение.
Список литературы
Критерии оценки
Введение.
Антитела, также называемые
иммуноглобулины, — это белки Y-формы,
функцией которых является выявление
и «помощь» в удалении из организма человека
чужеродных антигенов. Антитела, вырабатываются
иммунной системой в ответ на присутствие
антигена. Каждое антитело распознает
и связывается со специфическим чужеродным
антигеном. Антигены — большие молекулы,
как правило, белки, находящиеся на поверхности
клеток, вирусов, грибков, бактерий или
это могут быть некоторые неживые вещества,
такие как токсины, химикаты или посторонние
частицы. Любое вещество, способное запустить
иммунный ответ называют антигеном.
Антитела циркулируют в крови,
соответственно им «доступна» любая часть
организма. Если циркулирующие антитела
вступают в контакт с «целью» или антигеном,
для борьбы с которым они были выработаны
иммунной системой, то антитела связываются
с мишенью. В зависимости от антигена, подобное
связывание может препятствовать развитию
биологических процессов, вызывающих
заболевание или может привести к уничтожению
инородного тела макрофагами.
Реакция иммунной системы на любой антиген,
даже самый простой, является поликлональной. То
есть, система производит много различных
антител для борьбы с различными антигенами. Моноклональные
антитела — клетки-клоны, «целью» каждой
из которых является тот специфический
антиген, для обнаружения и связывания
с которым иммунная система выработала
специфическое антитело, ставшее клеткой-предшественницей
.
Гуманизированные моноклональные антитела
В терапии моноклональными антитела
- антитела, которые синтезированы
в лаборатории, а не собственной иммунной
системой человека. Как только моноклональные
антитела попадают в организм, они «побуждают»
другие компоненты иммунной системы к
уничтожению целевых антигенов, таких,
как, например, раковые клетки.
Первые моноклональные антитела,
синтезированные в лабораторных условиях,
полностью состояли из белков мыши. Проблема
состояла в том, что иммунная система человека
распознавала эти антитела как чужеродные
и принимала ответные меры против них. В
краткосрочной перспективе это означало
стимуляцию иммунного ответа. В долгосрочной
перспективе, иммунная система организма
уничтожала их прежде, чем они могли оказать
лечебный эффект.
Со временем, исследователи
научились заменять некоторые части белков
мышиных антител на белковые компоненты
человека, такие антитела стали известны
как химерические. Поскольку доля белковых
компонентов человека, используемых в
составе мышиных антител увеличивалась,
они получили название гуманизированных антител.
Некоторые моноклональные антитела в
настоящее время полностью являются белком
человека, а это означает, что они, вероятно,
будут еще более безопасными и могут быть
более эффективными, чем ранее синтезированные
моноклональные антитела.
1. Моноклональные
антитела. Общие свойства моноклональных
антител.
Моноклональные антитела - антитела,
вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими
к одному клеточному клону, то есть произошедшими
из одной клетки-предшественницы. Моноклональные
антитела распознают и связывают антигены
для распознавания специфических эпитопов,
которые обеспечивают защиту против болезнетворных
организмов.
Моноклональные антитела (монАТ), в отличие
от поликлональных, являются продуктом
секреции одной антитело- продуцирующей
клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся
в процессе деления этой клетки. Все монАТ,
являющиеся продуктом одного клона, представлены
идентичными молекулами, отсюда вытекают
основные свойства моноклональных антител:
а) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом
одного клона, имеют одинаковую специфичность,
то есть, направлены против одинаковых
мест связывания (антигенных детерминант)
на каком-либо конкретном антигене, тогда
как поликлональная сыворотка имеет в
своем составе антитела к разным участкам
связывания с антигенам и даже к разным
антигенам.
б) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом
одного клона, имеют одинаковое сродство
к связываемому антигену (аффинность),
то есть моноклональные антитела бывают
высокоаффинными («прочно» связывающие
антиген) и низкоаффинные (образующие
легко диссоциирующий комплекс с антигеном).
Поликлональная сыворотка всегда представлена
антителами разной аффинности.
в) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом
одного клона, имеют один изотип и субизотип
иммуноглобулинов, чего нельзя сказать
о поликлональной сыворотке.
2. Гибридомная
технология.
Гибридома — гибридная клеточная линия,
полученная в результате слияния клеток
двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов,
полученных из селезёнки иммунизированного
животного (чаще всего мыши), и раковых
клеток миеломы. Слияние клеток производится
с помощью нарушающего мембраны агента,
такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай.
Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны»,
то есть способны делиться большое количество
раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома,
производящая моноклональные антитела против
антигена может поддерживаться долгое
время. В 1984 г. за открытие принципа получения
моноклональных антител Мильштейн, Кёлер и Ерне получили Нобелевскую
премию по физиологии и медицине.
Наиболее перспективным направлением
является гибридомная технология. Гибридные
клетки (гибридомы) образуются в результате
слияния клеток с различными генетическими
программами, например, нормальных дифференцированных
и трансформированных клеток.
3. Получение моноклональных
антител.Основные этапы получения
моноклональных антител методом гибридомной
технологии.
А. Моноклональные
антитела(кратко).
Долгое время единственным источником
монАТ были опухолевые линии антитело- продуцирующих
клеток миеломы и плазмацитомы, выделенные
из больных людей и животных. Такие клетки
могли быть адаптированы к росту в культуральных
средах и секретировать моноклональные
антитела, но было очень трудно и зачастую
даже невозможно определить антиген, к
которому эти антитела были направлены.
Понятно, что использование таких монАТ
было очень ограничено. Ситуация кардинально
изменилась в 1975 году, когда ученые Kohler и Milshtein предложили
метод получения моноклональных антител
предопределенной специфичности, за что
позднее были удостоены Нобелевской премии.
Смысл гибридомной технологии заключается
в создании гибридной клетки, получаемой
путем слияния антитело- продуцирующего
В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного
или плазмацитомного ряда. Такая гибридома
обладает свойством секретировать антитела,
взятой у В-лимфоцита, и способностью к
бесконечному делению, взятой у опухолевой
клетки.
Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат
лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем
антигеном, против которого хотят получить монАТ. Гипериммунизация сильно
повышает процентное содержание В-лимфоцитов,
продуцирующих антитела желаемой специфичности,
в общей популяции клеток лимфоидного
органа. Лимфоциты, выделенные из тканей
селезенки, лимфоузлов, периферической
крови, не способны к самостоятельному
делению и живут в культуре всего 10-14 дней.
Миеломные клетки, напротив, могут жить
и делиться в культуре сколь угодно долго,
но не продуцируют антитела нужной специфичности
(чаще используют линии миелом или плазмацитом,
вообще не продуцирующие никаких антител).
В результате процедуры гибридизации
(слияния) образуется гетерогенная популяция
клеток, состоящая, во-первых, из неслившихся клеток
лимфоидного органа; во-вторых, из неслившихся клеток
миеломы; в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома;
в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома,
из которых лишь часть (часто весьма небольшая)
стабильно продуцирует антитела нужной
специфичности. Понятно, что необходимо
отделить интересующие клетки от всех
остальных. От неслившихся лимфоцитов и
гибридов лимфоцит+лимфоцит избавляться
не нужно: через несколько дней они умрут
сами; от неслившихся опухолевых клеток
и гибридов миелома+ миелома избавляются
с помощью селективных сред (подробности
ниже); среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит+миелома)
отбирают нужные путем клонирования, когда
из одной клетки выращивают популяцию
клеток (клеточный клон) и отбирают среди
таких клонов лишь те, которые стабильно
продуцируют антитела требуемой специфичности.
Секрецию антител определяют различными
методами скрининга супернатантов гибридом,
другими словами, проводят анализ той культуральной среды,
в которой рос конкретный клон. При наличии
в супернатанте желаемых антител проводят
еще одно или несколько клонирований, затем
клетки нарабатывают для получения большего
количества антител либо в культуре, либо
в перитонеальной полости мышей. Далее
антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости
и проводят более детальные исследования
на предмет их пригодности для использования
в тех целях, для которых монАТ были получены.
Клетки–продуценты можно заморозить
и хранить в жидком азоте долгое время.
Моноклональные антитела (МАТ)
секретируются иммунными клетками, происходящими
от единственной антителообразующей клетки.
Поэтому МАТ направлены только против
определенного эпитопа иммуногенного
вещества, так называемой "антигенной детерминанты". Для получения МАТ изолируют лимфоциты из селезенки иммунизированной
мыши (1) и производят их слияние с
опухолевыми клетками мыши (клетками миеломы)
(2). Это необходимо, так как жизнеспособность
антителопродуцирующих лимфоцитов в культуре
ограничена лишь несколькими неделями.
При слиянии с опухолевой клеткой возникают
гибридные клетки, так называемые гибридомы, которые являются потенциально
бессмертными.
Слияние клеток (2) является редким событием,
частота которого повышается в присутствии
полиэтиленгликоля [ПЭГ (PEG)]. Отбор продуктивных
гибридных клеток проводится при длительной
инкубации первичной культуры в ГАТ-среде (НАТ-среде) (3), содержащей гипоксантин, аминоптерин
и тимидин. Аминоптерин, аналог дигидрофолиевой кислоты,
конкурентно ингибирует дигидрофолат-редуктазу и тем самым биосинтез дТМФ.
Поскольку дТМФ существенно необходим
для синтеза ДНК, миеломные клетки не могут
выживать в присутствии аминоптерина.
С другой стороны, клетки селезенки могут
преодолевать действие ингибитора, используя
для синтеза ДНК гипоксантин и тимидин,однако и они существуют
в течение ограниченного времени. Только
гибридома выживает в виде культуры в
среде ГАТ, так как эти клетки обладают
одновременно бессмертием миеломных клеток
и способностью клеток селезенки приспосабливаться
к аминоптерину.
в действительности продуцировать
антитела способны только единичные гибридомные
клетки. Такие клетки необходимо выделить
и размножить клонированием (4). После тестирования клонов
на способность образовывать антитела
отбираются положительные культуры, которые
снова клонируются и подвергаются последующей
селекции (5). В результате получают гибридому,
продуцирующую моноклональные антитела. Производство
моноклональных антител этими клетками
осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши (6).
Б. Иммуноанализ
Иммуноанализ — это полуколичественный
метод определения содержания веществ,
присутствующих в очень низких концентрациях.
В принципе иммуноанализом можно определять
любые соединения, вызывающие образование
антител.
Основой этого метода является «реакция» антиген-антитело, т. е. специфическое связывание
антитела с определяемым веществом. Из
многих разработанных методов иммуноанализа,
таких, как радиоммунный анализ (РИА), хемилюминесцентный иммуноанализ и т.д., здесь рассматривается
вариант иммуноферментного
анализа (ИФА).