Для культивирования клеток при низкой
клеточной плотности (особенно при клонировании,
когда из одной- единственной клетки в
лунке необходимо вырастить целый клон)
используют так называемый фидерный слой
клеток (или просто фидер), облегчающий
эту задачу. Клетки фидера не должны самостоятельно
делиться, они призваны обеспечивать гибридомные
клетки необходимыми для роста цитокинами
и создавать клеточные контакты. В качестве
фидера можно использовать клетки тимуса,
селезенки, лимфоузлов, перитонеальной
полости животных того вида, который использовался
для получения иммунных В-лимфоцитов.
Фидер от животных другого вида тоже может
быть использован, но с меньшей эффективностью.
Культивирование клеток необходимо проводить
в условиях, максимально приближенных
к стерильным. Попавшие в культуру клеток
бактерии и грибы, опережая гибридомы
в скорости роста, очень быстро исчерпают
питательные вещества ростовой среды
и насытят ее своими токсинами. Это приведет
к неизбежной гибели гибридомных клеток.
Во избежание инфицирования пользуются
стерильными ростовыми средами и стерильной
культуральной посудой, применяют антибиотики,
а все манипуляции с клетками проводят
в условиях минимальной осемененности
микробами (в ламинарном боксе с принудительной
подачей стерильного воздуха).
Особую проблему представляет заражение
клеток внутриклеточными паразитами-
вирусами и микоплазмой. Детектировать
их достаточно сложно, они, как правило,
не убивают всю культуру гибридомных клеток
и с легкостью переносятся от одной культуры
к другой. Вирусы и микоплазма фильтруются
сквозь бактериальные фильтры, поэтому
фильтрование ростовых сред и воздуха
в ламинарном боксе становятся неэффективными
при борьбе с ними. Заражение клеток вирусами
или микоплазмой приводит к резкому замедлению
роста клеток, особенно в малой их плотности,
а также к усиленной потере гибридомами
их способности секретировать антитела.
Против микоплазмы существуют специальные
антибиотики, а против вирусов- интерфероны,
но они помогают лишь снизить степень
инфицированности клеток, не избавляя
их от инфекции полностью. Более действенным
является сочетание антибиотиков с неоднократным
проведением зараженной культуры через
организм животного, где клетки могут
расти в виде асцитной жидкости и использовать
иммунную систему животного против инфекции.
Скрининг супернатантов гибридом.
Через несколько дней после процедуры
слияния заметен рост гибридомных клонов
на фоне отмерших неслившихся миеломных
клеток и меньших по размеру неделящихся
В-лимфоцитов. На 6-14 после слияния день,
когда размер клонов обычно достигает
нескольких сотен клеток, необходимо протестировать
супернатанты гибридом на содержание
антител к требуемому антигену (иначе
говоря, провести скрининг).
Клонирование гибридом.
Сразу после обнаружения в лунке с растущим
клоном (или несколькими клонами) желаемых
антител, нужно возможно скорее провести
клонирование. 1. Метод клонирования в
мягком агаре.
Отцы гибридомной технологии Келер и
Мильштейн в своей пионерской работе использовали
метод клонирования в мягком агаре. Сегодня
этот метод имеет скорее историческое,
нежели практическое значение. Гибридомы
после процедуры слияния высевали в чашке
Петри на стерильном 1%-ом агаре, приготовленном
на селективной ростовой среде с аминоптерином.
Белые бляшки растущих клонов тестировали
на наличие специфических антител, используя
метод фиксации комплемента. Те бляшки,
вокруг которых наблюдали лизис эритроцитов
барана, вырезали скальпелем, клетки суспендировали
в ростовой среде и затем вновь высевали
на агар. Процедуру повторяли до тех пор,
пока не отбирали клоны, стабильно продуцирующие
нужные антитела. Такие антитела являются
моноклональными, поскольку секретируются
клоном, выращенным из одной клетки.
Клонирование методом
предельных разведений.
Самым распространенным сегодня методом
клонирования является метод предельных
разведений. Смысл его состоит в том, чтобы
суспензию клеток развести в ростовой
среде до такой концентрации, чтобы при
посеве клеток на планшет в каждой лунке
оказалась бы одна гибридомная клетка.
На практике такое недостижимо, даже при
самом тщательном расчете в какие-то лунки
попадет две или даже большее число клеток,
в какие-то не попадет вовсе. Кроме того,
не все клетки могут выжить в тяжелых для
них условиях одиночества и дать начало
жизнеспособному клону. Поэтому делают
несколько разных разведений клеток (как
правило, три), в первом из них концентрацию
клеток берут приблизительно равной 10
клеток на лунку, во втором- одна клетка
на лунку, и в третьем- 0,1 на лунку. Приведенные
цифры в разных пособиях могут варьировать.
Клетки высевают, используя фидерный слой
клеток, поскольку у одинокой гибридомной
клетки практически нет шансов выжить
в лунке.
Через несколько дней просматривают
под микроскопом все лунки и фиксируют
количество растущих в них клонов. Лунки
с одним растущим клоном осматривают особенно
тщательно на предмет отсутствия в них
вторых мелких и малозаметных клонов.
Затем, когда клоны достигнут достаточного
для тестирования размера, проводят скрининг
их супернатантов, используя тот же метод,
что и для тестирования первичных клонов.
Среди клонов, давших при тестировании
положительный результат, отбирают самые
продуктивные и здоровые на вид и повторяют
процедуру клонирования. Если после второго
клонирования все протестированные клоны
дали положительный результат, самые лучшие
из них отбирают для дальнейшей работы
(наработки, заморозки и т.д.). В случае
обнаружения несекретирующих клонов,
что говорит о неустойчивой секреции антител,
необходимо повторить клонирование, либо
отказаться от дальнейшего использования
этого клона.
Клонирование с помощью
приборов.
В последнее время все большую популярность
приобретают микроманипуляторы- приборы,
позволяющие под визуальным контролем
стерильно перенести одну выбранную клетку
из одного культурального планшета в другой.
Этот метод особенно удобен, если в лунке
с положительно протестированным супернатантом
имеется несколько клонов. Прибор позволяет
взять из всех, даже самых маленьких клонов
по несколько клеток и рассадить их по
одной в лунки. Налицо экономия культуральной
посуды и ростовых сред.
Другим прибором, использующимся для
клонирования, является упомянутый выше
проточный цитофлуориметр. Он может предложенную
ему суспензию клеток рассадить по одной
клетке в лунки культурального планшета.
Наработка гибридомных клеток
и секретируемых ими антител.
Наиболее широко используются сейчас
два способа наработки гибридомных клеток
и моноклональных антител: наработка на
культуральных средах в СО2 инкубаторе
и в асцитных жидкостях мышей (или крыс).
Каждый из них имеет свои достоинства
и недостатки.
Наработка на культуральных
средах в СО2 инкубаторе.
После того, как отобраны стабильно продуцирующие
клоны, переходят к наработке антител,
чтобы получить достаточное их количество
для более подробного изучения их свойств. Гибридомные
клетки очень чувствительны к перемене
условий их содержания, поэтому необходима
плавность и постепенность при увеличении
объема ростовой среды и культуральной
посуды: из одной лунки 96-луночного планшета
клетки рассевают на несколько лунок такого
же планшета, затем, когда плотность клеток
в них будет достаточно большой, клетки
из нескольких лунок переносят в одну
лунку большего размера и т.д. Когда количество
клеток будет достаточным для производства
требуемых количеств антител, содержание
эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)
в ростовой среде постепенно или резко
снижают (до концентрации <1%). Рост и деление
клеток при этом сильно замедляется, клетки
переключаются на секрецию антител. Супернатанты
клеток стерильно отбирают, проверяют
на содержание специфичных антител и собирают
для дальнейшей очистки.
Для наработки антител в промышленных
масштабах используют различные приспособления
(цитокультиваторы, ферментеры и т.д.),
в которых соблюдаются необходимые условия
культивации клеток (температура, уровень
СО2 и влажности), а также частично или полностью
автоматизированы подача питательных
сред и отбор супернатантов.
Наработка антител в асцитных
жидкостях.
Наименее хлопотный способ наработать
большое количество антител- это ввести
гибридомные клетки в перитонеальную
полость мыши (или крысы). Через 6-30 дней
(чаще через 10-14) в зависимости от числа
введенных клеток и скорости их деления
в перитонеальной полости образуется
асцитная жидкость, содержащая большое
количество гибридомных клеток и монАТ
(концентрация антител в асцитах может
достигать 20мг/мл). Для лучшей приживаемости
гибридомных клеток и во избежание развития
солидных (твердых) опухолей мышам предварительно
(за 7-20 дней до введения клеток) вводят
минеральное масло- пристан. Если все-таки
вместо асцитной жидкости образовалась
солидная опухоль, ее извлекают, гомогенизируют,
и в фосфатно- солевом буфере вводят другим
мышам.
В процессе развития асцитной опухоли
клетки гибридомы оздоравливаются, избавляются
от бактериальной и вирусной инфекций. Скорость
роста извлеченных из асцита клеток, как
правило, значительно выше, чем до введения
их в перитонеальную полость мышей.
Количество клеток, вводимых мышам, может
быть любым: от нескольких десятков или
сотен клеток до нескольких сотен миллионов.
Однако следует учитывать, что при очень
маленьком количестве вводимых клеток
увеличивается время образования асцита,
при очень большом- есть риск гибели мыши,
если клетки заражены микоплазмой. В целом
успех выращивания асцитной жидкости
зависит, в основном, от качества мышей
(их линейности - генетического соответствия
требуемой линии).
Наработке антител в асцитных жидкостях
во многих странах препятствует законодательство,
считая эту процедуру негуманной по отношению
к животным. В нашей стране пока такого
запрета нет, но соответствующий законопроект
уже обсуждается.
Наработка антител с использованием
генноинженерных методов применяется
только для наиболее ценных гибридом.
Хранение клеток.
Клетки годами можно хранить в жидком
азоте без существенной потери их жизнеспособности.
Заморозку клеток производят, когда они
находятся в логарифмической фазе роста.
Суспензию клеток, предназначенных для
заморозки, помещают в раствор, содержащий
10-90% сыворотки, 5-10% ДМСО и в остальном- ростовую
среду. Присутствие сыворотки смягчает
процессы замораживания- оттаивания клеток,
ДМСО препятствует при заморозке образованию
крупных кристаллов воды, губительных
для клеточной стенки.
Понижение температуры при заморозке
производят постепенно, существуют даже
специальные приборы, позволяющие снижать
температуру с заданной скоростью. В основном
же бывает достаточно предварительно
поместить ампулу с клетками в морозильник
на -70ºС, а затем перенести в специальный
сосуд с жидким азотом (сосуд Дьюара). Неудобство
хранения клеток жидком азоте состоит в
необходимости регулярно доливать азот
в эти сосуды. Для менее продолжительного
хранения клеток можно использовать морозильники
с температурой от -70ºС и ниже.
Наиболее ценные гибридомы можно хранить
в виде векторов (плазмид или нитчатых
фагов), куда вставлены гены, кодирующие
иммуноглобулины этих гибридом. Этот метод
хранения более надежен, но требует предварительной
работы по изготовлению таких векторов.
4. Основные области применения
мкат в иммунологии.
Области применения моноклональных антител:
• с диагностической целью: определение
экспрессии различных молекул;
• блокада рецепторов;
• инактивация и лизис клеток (лечение
онкологических и аутоиммунных заболеваний).
• для предотвращения отторжения при трансплантации
органов,
Сначала были созданы гетероиммунные
антитела (мышиные античеловеческие, овечьи
антимышиные и т.д.). Их используют в основном
для диагностических целей и селекции
клеток. При введении в организм человека
они вызывают выработку антител.
Моноклональные антитела для терапии
рака
Моноклональные антитела различаются
не только по своей целевой мишени, но и по способу
борьбы с раковыми клетками. Их разделают
на две большие группы: конъюгированные и неконъюгированные.
Первые действуют сами, вторые таргетно
(прицельно) доносят до раковых клеток то,
что на них «навесили» ученые, — например,
лекарство.
Первые моноклональные тела,
используемые учеными, были мышиными.
Но, поскольку они были чужими для человеческого
организма, их введение само могло спровоцировать
иммунный ответ. В связи в этим ученые начали
заменять те участки животных мАт-белков,
которые не связываются с целевым антигеном,
на человеческие. Первые подобные разработки
получили название «химерных» антител —
по аналогии с древнегреческим чудовищем
Химерой. Дальнейшие усилия были направлены
на сокращение количества мышиных участков
антител и, соответственно, увеличение
количества человеческих. Следующее поколение
препаратов, созданных в результате этого, —
гуманизированные мАт, на которые иммунная
система реагирует уже слабо. Наконец,
сейчас есть и полностью человеческие
антитела.