Образцы сыворотки крови, содержащие
определяемое вещество, к примеру гормон
тироксин, помещаются в лунки планшета
для микротитрования (1), на стенках которых сорбированы антитела, способные специфически связывать
гормон. Одновременно в инкубационную
смесь вносится небольшое количество
тироксина, химически связанного с ферментом,
так называемый конъюгат (1). Конъюгат и определяемый гормон
конкурируют между собой за связывание
с ограниченным количеством сорбированных
антител. После того как связывание антигенов
произошло (2), несвязавшиеся молекулы отмывают.
Для определения количества связавшегося
конъюгированного антигена в лунки вносят
растворхромогенного субстрата (субстратный буфер) и окрашенные
продукты ферментативной реакции (3) определяют фотометрически
(4).
Чем большее количество конъюгата
свяжется с антителами, сорбированными
на стенках лунки микропланшета, тем выше
содержание окрашенного продукта ферментативной
реакции. В то же время, чем больше гормона
в тестируемой пробе, тем меньше конъюгата
будет связываться с антителами. Количественная
оценка осуществляется с помощью градуировочной
кривой, которую строят по стандартным
образцам с известной концентрацией, проводя
несколько параллельных измерений.
Этапы получения монАТ(развернуто) :
Иммунизация.
Иммунизация- самый «творческий» этап
в процессе получения моноклональных
антител, именно эффективностью иммунизации
определяется в наибольшей степени конечный
успех всего предприятия. Тут невозможно
дать какой-то единый рецепт, поскольку
выбор схемы иммунизации и использование
различных приемов, повышающих эффективность
иммунизации, целиком зависят от свойств
конкретного антигена.
Выбор объекта иммунизации.
В первую очередь необходимо выбрать
объект иммунизации. На сегодняшний день
известны три вида гибридомных систем: мышиная,
крысиная и человеческая. Самой распространенной
сегодня является мышиная гибридома, а
самая редкая- человеческая, чему имеется
ряд причин:
а) Мыши- наиболее хорошо изученный и доступный
объект для работы в лаборатории, то же
относится и к линиям мышиных миелом, используемых
для слияния.
б) Все линии крысиных миелом, адаптированные
для гибридомных работ, запатентованы,
поэтому коммерческое использование крысиных
гибридом регламентируется соответствующими
патентами. Все мышиные линии миелом свободны
от патентных ограничений.
в) Гипериммунизацию грызунов провести
проще, чем иммунизацию человека. В большинстве
случаев гипериммунизация человека вообще
невозможна по этическим соображениям.
г) Источником иммунных В-лимфоцитов
грызунов могут служить ткани любых лимфоидных
органов, тогда как у человека возможно
лишь взять периферическую кровь, где
общее содержание В-лимфоцитов не превышает
20% от всех клеток. В редких случаях можно
использовать удаленные миндалины пациентов,
где содержание В-лимфоцитов может достигать
60%, но они, как правило, инфицированы и
секретируют антитела именно против этого
инфекционного агента.
д) При получении человеческой гибридомы
существует проблема гистосовместимости
клеток миеломы и В-лимфоцитов: у грызунов
для слияния берутся В-лимфоциты и клетки
миеломы, полученные от одной линии животных,
и поэтому имеющих сходный репертуар антигенов
гистосовместимости на клеточных поверхностях.
Для человека это условие недостижимо,
что в конечном итоге выражается очень
низкой эффективностью слияния и крайне
нестабильной антителопродукцией человеческих
гибридом.
е) Мышиные и крысиные антитела достаточно
просто нарабатывать в асцитных жидкостях;
для человеческих гибридом возможна наработка
лишь в культуре, либо с применением генноинженерных
методов.
Схемы иммунизации мышей.
Короткая схема иммунизации.
Наиболее любима нашей лабораторией
короткая схема иммунизации, когда антиген
вводят дважды с двухнедельным интервалом
в подушечки задних лап. Количество вводимого
антигена берут в пределах от 5 до 200мкг
на мышь в зависимости от его доступности
и иммуногенности, для токсичных антигенов
доза может быть понижена до 0,1мкг. Для
первого введения антигена (раунда иммунизации)
раствор антигена объемом 50-200 мкл смешивают
с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), представляющего
собой минеральное масло совзвесью убитых
микобактерий. При активном перемешивании
раствора антигена с ПАФ получается мелкодисперсная
эмульсия, призванная замедлить и пролонгировать
поступление антигена в ткани. Считается,
что убитые микобактерии усиливают иммунный
ответ, что, однако, у многих исследователей
вызывает сомнение. Второй раунд иммунизации
проводят так же, как и первый, но с использованием
неполного адъюванта Фрейнда (НАФ), в котором
отсутствуют микобактерии.
В случае проблемных антигенов полезно
иммунизировать группу животных разными
дозами антигена и с использованием разных
схем иммунизации. На третий или четвертый
день после второго раунда иммунизации
нужно взять пробы крови и проанализировать
их на содержание антител против требуемого
антигена. Для дальнейшей работы выбирают
животное с максимальным титром, исключение
составляют антигены- белковые токсины,
где иногда высокий титр специфических
антител сочетается с большим процентом
убитых токсином В-лимфоцитов. В таких
случаях нужно брать животное, имеющее
не самый высокий титр и/или обращать внимание
на жизнеспособность клеток, берущихся
для слияния.
На четвертый день после второго раунда
иммунизации животное забивают, и клетки
подколенных лимфоузлов сливают с клетками
миеломы.
Длинные схемы иммунизации.
В случае неэффективности короткой схемы
иммунизации пробуют различные виды длинных
схем. При этом обычно животных иммунизируют
с интервалом 2-4 недели либо внутрибрюшинно,
либо подкожно (реже внутривенно или орально),
используя для первого раунда иммунизации
ПАФ, а для последующих- НАФ.
На 10-14 день после каждого раунда иммунизации
(начиная со второго) кровь иммунизируемых
животных проверяют на содержание специфических
антител. Если титр антител достиг желаемого
уровня, проводят последний раунд иммунизации
(называемый бустированием), вводя раствор
антигена внутривенно без адъювантов,
в количестве 1/10 от предыдущих доз. В результате
бустирования избирательно стимулируются
клоны, продуцирующие антитела высокой аффинности
к антигену.
Некоторые приемы, позволяющие
усилить иммунный ответ.
Конъюгация (химическая
сшивка) низкомолекулярного антигена
(гаптена) с белком- носителем.
Существует целый ряд низкомолекулярных
соединений, не способных самостоятельно
вызвать иммунный ответ по причине малого
размера молекулы. В таких случаях гаптен
конъюгируют с белком- носителем (часто
в качестве белка- носителя берут бычий
сывороточный альбумин, яичный альбумин
или гемоцианин улитки) и такой конъюгат
используют для иммунизации. При этом
возникает целый ряд проблем:
а) Основной иммунный ответ будет направлен
на белок- носитель, а не на молекулу гаптена,
и это нужно будет учитывать при тестировании
сывороток иммунизируемых животных и
супернатантов гибридом. Тестирование
должно отражать содержание антител именно
к гаптену, а не к конъюгату в целом.
б) Пространственное строение гаптена
(конформация), как правило, существенно
изменяется в процессе конъюгирования
с носителем, иногда настолько, что все
антитела против участков гаптена, находящегося
в составе конъюгата, не способны узнавать
свободную молекулу гаптена. В таких случаях
пробуют разные варианты конъюгирования,
которые затрагивают при сшивке разные
функциональные группы молекулы гаптена,
либо используют разные «линкеры»- органические
соединения, связывающие функциональные
группы гаптена и белка- носителя и увеличивающие
экспонированность гаптена на поверхности
носителя.
В целом метод конъюгирования хорошо
зарекомендовал себя при получении антител
против низкомолекулярных соединений.
Иммунизация иммунными
комплексами (антиген- антитело).
Метод применяют, когда антигеном является
консервативный низкоиммуногенный белок,
либо, когда хотят получить антитела против
минорных антигенных детерминант, на которые
при иммунном ответе направлен очень низкий
процент всех специфических антител. В
первом случае антительным компонентом
иммунного комплекса могут служить монАТ
с неудовлетворительной аффинностью,
полученные ранее после обычной иммунизации. Во
втором случае берут монАТ против сильных антигенных
детерминант, получение которых не представляет
большой сложности.
Примером успешного использования такого
подхода может служить получение антител
против человеческого эритропоэтина,
α и γ интерферонов, иммуноглобулинов
близкородственных видов (крысиные монАТ
против IgG мыши).
Конъюгация с адъювантным
белком (hsp70).
Встречаются антигены, которые в силу
своей сверх-консервативности не способны
вызвать сколько-нибудь заметный иммунный
ответ, несмотря на свою белковую природу
и достаточный молекулярный вес (например,
гемоглобин, некоторые ферменты). Выходом
здесь может стать конъюгирование их с
белком теплового шока (heat shock protein 70kDa, hsp70).
Имеются данные, что hsp70 облегчает презентацию
пептидных фрагментов, экспонируя их определенным
образом, на практике же конъюгирование
белков и пептидов с hsp70 приводит, как правило,
к резкому усилению выработки антител
против этих белков и пептидов.
Однако, случается полное подавление
иммунного ответа в результате конъюгирования
с hsp70, которое мы неоднократно наблюдали
при иммунизации конъюгатом hsp70- интерферон
γ.
3.3. Предварительная обработка антигенов
перед иммунизацией.
а) Токсичные антигены часто подвергают
денатурации нагреванием или добавлением
денатурирующих агентов (мочевины, гуанидилхлорида
и др.). Токсичность при этом снижается
(не всегда), но утрачиваются многие антигенные
детерминанты, присущие неденатурированному
(нативному) антигену. В результате получаемые монАТ
узнают лучше денатурированный антиген.
б) Иногда молекулы антигена сшивают
друг с другом (полимеризуют) с целью увеличения
молекулярного веса и/или уменьшения токсичности.
в) Вирусы и бактерии перед иммунизацией,
как правило, инактивируют нагреванием,
либо обработкой фенолом, формальдегидом,
глутаральдегидом и др. для уменьшения
их токсичности и эпидемиологической
опасности. Грамотрицательные бактерии,
кроме того, иногда обрабатывают лизоцимом,
чтобы убрать ЛПС с их поверхности и обеспечить
иммунный ответ против бактериальных
белков.
Гибридизация В-лимфоцита
с клеткой миеломы.
Отцы гибридомной технологии Келер и
Мильштейн добивались слияния клеток
при помощи вируса Сендай. Сейчас для этой
цели все используют полиэтиленгликоль
(ПЭГ), как более удобное, эффективное и
безопасное средство. Формула ПЭГ:
HO(CH2CH2O)n CH2CH2OH , молекулярный вес ПЭГ, пригодного
для слияния, от 20 до 20000, но чаще используют
ПЭГ массой 600-6 000.
Полиэтиленгликоль токсичен для клеток,
и его токсичность возрастает с уменьшением
молекулярного веса. Слияние клеток происходит
во время инкубации их в 35-50% ПЭГ, время
инкубации зависит от концентрации ПЭГ
и от его молекулярного веса (для 50% ПЭГ
мол. веса 1 500 это приблизительно 1 минута).
Недостаточное время инкубации приведут
к очень низкому проценту слившихся клеток,
а избыточное- к большому проценту погибших
клеток вследствие токсичности ПЭГ. Хорошо
работает такой компромиссный вариант,
когда клетки сначала инкубируются при
мягком перемешивании в 50% ПЭГ в течение
1 мин, затем процент ПЭГ снижается до 35%
медленным добавлением бессывороточной
среды, и клетки инкубируются еще 5-7 минут.
Затем медленно, но с нарастающим темпом
и при аккуратном перемешивании суспензия
клеток далее разбавляется средой, потом
центрифугируется и высевается на культуральные
планшеты.
Точный механизм гибридизации клеток
еще недостаточно изучен. Вначале, по-видимому,
происходит агглютинация (склеивание)
клеток, затем слияние клеточных мембран
и, наконец, слияние ядер и перестройки
хромосомного материала. Имеются данные,
что сливаются, в основном, клетки, находящиеся
в стадии интенсивного деления. По этой
причине клетки миеломы за 12-24 часа до
гибридизации переводят в условия, способствующие
максимальной скорости роста клеток (повышение
содержания фетальной сыворотки, витаминов
и ростовых факторов в культуральной среде).
Иммунизация в свою очередь стимулирует
рост клонов В-лимфоцитов- продуцентов
специфических к антигену антител.
Культивирование клеток.
Обычные условия культивирования миеломных
и гибридомных клеток- 37°С и 5% СО2. Основа
культуральной среды- это разные варианты
предлагаемых на рынке сред , представляющих
собой раствор солей, аминокислот, витаминов,
углеводов и питательных добавок в разных
концентрациях и цветового индикатора
кислотности. Кроме этого к среде добавляют
эмбриональную телячью сыворотку или
ее синтетические или полусинтетические
заменители до концентрации 3-20% как источник
белка и ростовых факторов. Качество сыворотки
в наибольшей степени влияет на скорость
роста клеток, особенно гибридомных, как
более капризных по сравнению с миеломными.
Помимо сыворотки в среду добавляют пируват
натрия, антибиотики, глутамин (если он
не содержался в исходной среде), реже- оксалоацетат,
бета-меркаптоэтанол, инсулин и др.