Окремі показники ліпідного обміну в нормі та при ряді патологічних станів

РОЗДІЛ 3

МЕТОДИКА  ПРОВЕДЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТУ

 

3.1. Матеріали та методи дослідження

Для з’ясування значення окремих  показників гомеостазу при порушенні обміну ліпідів за умов розвитку серцево-судинних захворювань, цукрового діабету та гіпотиреозу, нами було проведено обстеження кількох груп осіб різної статі, віком 30-65 років. Групи формували залежно від мети дослідження. В кожну групу обстежених включали не менше 7 осіб для забезпечення можливості проведення статистичної обробки даних. Визначення окремих показників гомеостазу та аналіз отриманих даних, для з’ясування їх значення у порушенні ліпідного обміну при серцево-судинній патології, цукровому діабеті та гіпотиреозі, проводили в клініко-біохімічній лабораторії. У вигляді біоматеріалу використовували сироватку крові хворих, які знаходились на стаціонарному та амбулаторному лікуванні в кардіологічному та ендокринологічному відділеннях Черкаської міської лікарні.

Дослідження проводилися  згідно  з положеннями Конвенції  Ради Європи «Про захист прав та гідності людини в аспекті біомедицини» (1997 р.), «Етичними принципами  медичних наукових досліджень із залученням людських суб’єктів», прийнятих 52-ю Асамблеєю Всесвітньої Медичної Асоціації (2000 р.), принципами Гельсінської декларації (1964 р.) та дотримання діючих нормативних вимог.

Предметом дослідження  були показники гомеостазу які, по суті, дають вичерпну відповідь на питання  щодо стану ліпідного обміну та наявності в організмі метаболічних розладів, які можуть спричинити розвиток серцево-судинних захворювань та ускладнень при цукровому діабеті та гіпотиреозі.

Незаперечним  є те, що практично всі серцево-судинні  розлади пов’язані, в першу чергу, з розвитком атеросклеротичних  змін в вінцевих судинах і судинах  мозку, визначення вказаних вище показників може надати вичерпну інформацію про наявність певної патології – ішемії, інфаркту міокарда, гіпертензії, інсульту.

Холестерин є обов’язковим компонентом рідин організму, в першу чергу цільної крові, сироватки, плазми. Вміст холестерину в рідинах організму є важливим показником гомеостазу і підтримується на певному сталому рівні за допомогою складних механізмів регуляції. За фізіологічних умов, вміст холестерину в крові складає, в середньому, 180-200 мг% (5,2 мМоль/л). Разом з тим, за умов патології вміст його в рідинах організму може зазнавати суттєвих змін, що негативно впливає на перебіг метаболічних процесів. Підвищення вмісту холестерину в рідинах організму – гіперхолестеринемія, може стати причиною розвитку різних захворювань, зокрема призвести до порушення функціонування серцево-судинної системи, ряду внутрішніх органів.

Для визначення холестерину нами було апробовано різні  методики (Ільке, Лібермана-Бурхарда) які  базуються на утворенні забарвленого комплексу холестерину в присутності  суміші неорганічних кислот. Ці методи є високочутливими і дають змогу виявити холестерин при використанні мікро-кількостей біоматеріалу.

Для визначення холестерину в сироватці крові  використовували один з уніфікованих методів – метод Ільке.

Принцип методу базується на тому, що холестерин в присутності оцтового ангідриду та суміші сульфатної та оцтової кислот дає зелене забарвлення,  інтенсивність якого пропорційна концентрації холестерину.

Реактиви, які  використовуються в цьому методі:

1. Реактив Ільке.  Змішують одну частину льодової оцтової кислоти, 5 частин оцтового ангідриду та 1 частину концентрованої сульфатної кислоти. Враховуючи те, що реакція проходить з виділенням тепла, реактив готують в термостійкому стакані, який охолоджують на льоду. Сульфатну кислоту додають в останню чергу, невеликими порціями при постійному помішуванні. Весь посуд, який контактує з реактивом, повинен бути абсолютно сухим, без слідів вологи. Правильно приготовлений реактив повинен бути прозорим, без кольору, або із ледь жовтуватим відтінком. Зберігати реактив слід у холодильнику в посуді з темного скла з притертою пробкою.

2. Хлороформ.

3. Абсолютний  етиловий спирт.

4. Стандартний  розчин холестерину – 5,2 мМоль/л. 200 мг холестерину розчиняють  в мірній колбі, ємкістю 100 мл  в 2,5 мл хлороформу і доводять до позначки абсолютним спиртом.

Існує ферментативний метод визначення холестерину, який знайшов широке застосування в клінічній  лабораторній діагностиці. Цим методом  можна визначати концентрацію холестерину  в діапазоні від 0,5 мМоль/л до 25,8 мМоль/л.

Принцип цього  методу базується на тому, що фермент  холестерин- естераза розщеплює етери  холестерину на вільний холестерин і жирні кислоти за схемою:

Ефіри холестерину  ←холестеринестераза→ холестерин + ВЖК (вільні жирні кислоти).

Далі проходить  окиснення холестерину за участю ферменту холестерин оксидази з утворенням Н₂О₂, який розкладається за участю пероксидази:

Холестерин  + О₂←холестериноксидаза→холестерин – 3-ОН + Н₂О₂

2 Н₂О₂ + 4 – амінофеназон + хромоген  ←пероксидаза→ хінонімін + 4 Н₂О

Інтенсивність рожево-червоного або бузкового забарвлення реакційного розчину пропорційна концентрації холестерину.

Використовуване обладнання:

1. Фотометричне  обладнання, що забезпечує вимірювання  оптичної щільності при 500 (500-550) нм у діапазоні (0-1,0) одиниць  оптичної щільності та довжиною оптичного шляху 5 мм або 10 мм. Можливе використання автоматичного аналізатора.

2. Автоматична  водяна баня або термостат,  що підтримують температуру плюс (37±1)⁰С.

3. Пробірки місткістю  10 мл.

4. Піпетки місткістю  1;2;5; і 0,05 мл.

Приготування  робочих розчинів:

1. Ензимний реагент  готовий до роботи. Після використання  реактиву для аналізу потрібно  негайно закрити флакон, щоб уникнути  випаровування або контамінації  реактиву.

2. Калібрувальний  розчин холестерину – готовий  до роботи. Після розкриття реактив зберігають у холодильнику.

Хід визначення

Аналіз проводять  у відповідності з такою схемою:

Відміряти  в  пробірку, мл	Дослідна  проба	Калібрувальна  проба	Холоста проба
Ензимний реагент	1,00	1,00	1,00
Дослідний розчин	0,01	—	—
Калібрувальний  розчин холестерину	—	0,01	—
Дистильована  вода	—	—	0,01

 

Розчин у  пробірці ретельно перемішують і  витримують у термостаті при температурі +37⁰С протягом 10 хвилин або інкубують 20 хвилин при температурі від +20⁰С до +25⁰С. Вимірюють оптичну густину дослідної проби (Е досл.) і калібр. проби (Е кал.) проти холостої проби. Рожево-червоне або бузкове забарвлення стабільне протягом 60 хвилин після закінчення інкубації.

Розрахунок  вмісту холестерину в дослідній  і контрольній пробі проводять  за формулою.

С =    Е досл. _X  5,17 мМоль/л, де

           Е кал. 

С – концентрація холестерину в дослідній пробі, мМоль/л;

Е досл. – оптична щільність  дослідної проби, одиниці оптичної густини;

Е калібр. – оптична щільність  калібрувальної проби, одиниці оптичної густини;

5,17 – концентрація холестерину  в калібрувальному розчині, мМоль/л.

Перерахунок одиниць: мг/100 мл x 0,02585 = мМоль/л

Застережні  заходи.

1. При роботі потрібно  використовувати гумові рукавички,  заборонено їсти, пити, курити.

2. Ензимний реагент включає  фенол (отруйна речовина).

Одночасно з  цим, на нашу думку, найдоцільнішим для  кількісного оцінювання вмісту холестерину  в рідинах організму є використання модифікації методу Лібермана-Бурхарда запропонованої Л.М. Лаврентієвою. Суть модифікації методу в тому, що досліджуваний розчин отриманий шляхом вилучення холестерину з 0,1 мл крові або її компонентів (плазми, сироватки, лейкоцитарної чи еритроцитарної маси) за участю органічного розчинника вносять в пробірку з притертою пробкою. Пробірку витримують на водяній бані до видалення органічного розчинника, охолоджують, додають 2,5 мл хлороформу і 0,5 мл оцтового ангідриду та 4-5 крапель концентрованої сульфатної кислоти, перемішують і залишають в охолодженій до 12ºС Н₂О до утворення синього або зеленого забарвлення. Через 60 хв. проводять колориметричне визначення холестерину при червоному світлофільтрі. За цих умов немає необхідності витримувати дослідну пробу в темноті. При застосуванні вказаної модифікації слід додавати достатню кількість H₂SO₄, оскільки збільшення її кількості може давати завищені показники холестерину на 2,5%. Перевагою модифікації є те, що на визначення холестерину не впливає присутність білірубіну.

Якщо концентрація холестерину в пробі вища, ніж 25,8 мМмоль/л, то пробу варто розвести фізіологічним розчином і аналіз провести повторно. Отриманий результат потрібно перемножити на розведення. 

Триацилгліцерини  визначали методом Карлсона і  Ігнатовської, який базується на тому, що гліцерин, який звільняється з триацилгліцеринів при гідролізі, взаємодіє з натрій перйодатом з утворенням формальдегіду, який визначають за кольоровою реакцією з хромотроповою кислотою.

Реактиви, які  використовуються в цьому методі:

1. Стандартний розчин трибутирину (200 мг%).
2. Хлороформ.
3. Активована кремнієва кислота.
4. 0,4% спиртовий розчин калій гідроксиду (готувати перед використанням).
5. 0,5% розчин натрій перйодату.
6. 5% розчин натрій бісульфіту.
7. Розчин хромотропової кислоти.
8. 0,7М розчин сульфатної кислоти.

Використовуване обладнання:

1. Фотометричне  обладнання, що забезпечує вимірювання  оптичної густини при 500 (500-550) нм у діапазоні (0-1,0) одиниць  оптичної густини та довжиною  оптичного шляху 3 мм. Можливе  використання автоматичного аналізатора.

2. Автоматична  водяна баня або термостат, що підтримують температуру плюс (37±1)⁰С.

3. Пробірки місткістю  10 мл. з притертими пробками.

4. Піпетки місткістю  1; 2; 5; і 0,05 мл.

5. Терези з  набором різноважок, мірний циліндр,  паперовий фільтр.

Хід визначення:

У пробірку з  притертою пробкою вносять 0,5 г активованої кремнієвої кислоти, 0,5 мл сироватки крові і 10 мл хлороформу, ретельно перемішують та залишають на 4 год. (можна на добу). Після цього вміст пробірки ще раз ретельно перемішують і профільтровують через паперовий фільтр, промитий хлороформом. Екстракт випарюють до утворення сухого залишку та розчиняють в 0,5 мл хлороформу.

Беруть три  сухі пробірки: в першу (дослідну) вносять 0,5 мл хлороформного екстракту, у  другу (стандартну) – 0,5 мл стандартного розчину трибутирину, у третю (контрольну) – 0,5 мл хлороформу. В кожну пробірку додають по 0,5 мл 0,4% розчину калій гідроксиду, перемішують і поставлять на водяну баню (60-70 ^оС) на  20 хв., після чого додають по 0,5 мл 0,7М розчину сульфатної кислоти та ставлять на водяну баню і витримують доки не зникне запах спирту (близько 20 хв.). Після охолодження в кожну пробірку додають по 1 краплі натрій перйодату, перемішують і через 10 хв. вносять по 1 краплі 5% розчину натрій бісульфіту, ретельно перемішують. Через 10 хв. додають по 5 мл хромотропової кислоти, ретельно перемішують та ставлять на киплячу водяну баню на 30 хв.

Охолоджують та визначають екстинкцію стандартної  і дослідної проби на ФЕК (зелений  світлофільтр, 500-560 нм, кювета довжиною оптичного шляху 3 мм) відносно контролю.

Розрахунок вмісту триацилгліцеринів у сироватці крові проводять за формулою:

                                           С_д. =   С_ст. · Е_д.     , де

Е_ст.

С_д. – вміст триацилгліцеринів у дослідній пробі (мг%);

С_ст. – вміст триацилгліцеринів у стандартній пробі (мг%);

Е_д. – екстинкція дослідної проби;

Е_ст. – екстинкція стандартної проби.

β ліпопротеїни визначали турбідиметричним методом  за Бурштейном і Самай, який базується  на тому, що кальцій хлорид та гепарин  порушують колоїдну стійкість білків сироватки крові, зумовлюючи преципітацію b-ліпопротеїнів і утворення каламуті. За ступенем помутніння визначають вміст цих фракцій у сироватці крові.