Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции

    [E][A]/[EA] = Km Поскольку [E] t  = [E] + [EA],

    [EА] = [E] t [А]/(Кm + [А])

    Из  v = kкат[EA] (2) и предыдущего выражения получают уравнение Михаэлиса-Ментен (4).

    Уравнение содержит две величины (два параметра), которые не зависят от концентрации субстрата [A], но характеризуют свойства фермента: это произведение kкат[E] t , соответствующее максимальной скорости реакции V при высокий концентрации субстрата, и константа Михаэлиса Кm, характеризующая сродство фермента к субстрату. Константа Михаэлиса численно равна той концентрации субстрата [A]. при которой ν достигает половины максимальной величины V (если v = V/2, то [A] / (Кm + [A]) = 1/2, т. е. Km = [А]). Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величиной Кm и наоборот, Модель Михаэлиса-Ментен основывается на нескольких не совсем реальных допущениях, таких, как необратимое превращение EA в E + В, достижение равновесия между E, A и EA, отсутствие в растворе других форм фермента, кроме E и EA. Только при соблюдении этих гипотетических условий Km соответствует константе диссоциации комплекса, а kкат — константе скорости peакции EA → E + В.

    Б. Определение V и Кm

    В принципе V и Кm можно определить по графику зависимости v от [A] (рис. слева). Так как v асимптотически достигает V с возрастанием концентрации субстрата [A], то затруднительно получить надежную величину V и Кm (рис. слева) путем экстраполяции.

    Для удобства расчетов уравнение Михаэлиса-Ментен можно преобразовать так, чтобы экспериментальные точки лежали на прямой. При одном из таких графических преобразований в так называемом графике Иди-Хофсти (pиc. справа) строят график зависимости v от v/[A]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью ординат соответствует V, а тангенс угла наклона равен -Km. Такой графический подход дня определения V и Кm также не оптимален. В настоящее время данные ферментативной кинетики обрабатывают быстрее и более объективно с помощью вычислительной техники. 
 
 

    Ферментативная  реакция

    Ферменты  специфически связывают реагенты (свои субстраты) в активном центре. При  этом субстраты ориентируются таким  образом, что приобретают оптимальное  положение для образования переходного  состояния (1-3). Сближение и необходимая  ориентации реагентов значительно  повышают вероятность образования  продуктивного комплекса A—B. Кроме  того, связывание субстрата в активном центре приводит к удалению гидратной оболочки субстрата.В результате удаления молекул воды в активном центре фермента во время катализа создаются совершенно другие условия, чем в растворе (3-5). Еще одним важным фактором является стабилизация переходного состояния вследствие взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом (4). Таким образом, переходное состояние в случае ферментативной реакции требует меньшей энергии активации. Кроме того, многие ферменты во время катализа переносят специфические группировки с субстрата или на субстрат. Особенно часто осуществляется перенос протонов. Этот ферментативный кислотно-основной катализ значительно более эффективен, чем обмен протонов с кислотами и основаниями в растворе. Часто химические группировки ковалентно присоединяются к остаткам фермента. Это явление называют ковалентным катализом. Принципы ферментативного катализа разъяснены на с. 104 на примере лактатдегидрогеназы.

      Основы ферментативного  катализа

    Несмотря  на то, что сегодня трудно количественно  оценить вклад отдельных каталитических эффектов, решающим фактором считается  стабилизация переходного состояния  в активном центре фермента. При  этом наиболее существенным моментом является прочное связывание не столько  субстрата, сколько его переходного  состояния. Данное положение подтверждается крайне высоким сродством многих ферментов по отношению к аналогам переходного состояния (см. c. 100), что можно пояснить простой механической аналогией (на схеме справа): если хотят перекатить металлические шарики (реагенты) с места EA (состояние субстрата) в энергетически более высокое переходное состояние, а затем в EP (состояние продукта), нужно расположить магнит (катализатор) таким образом, чтобы сила притяжения действовала не на EA (а), а на переходное состояние (б). 

5. Выделение продуктов ферментации.

    Ферментация - это процесс биохимического, очень  часто бескислородного разложения органических соединений, проходящий при участии энзимов (ферментов). Конечные продукты этого процесса - более простые органические и неорганические соединения, а также энергия. Ферментация - процесс, напоминающий дыхание; на ней, например, основан метаболизм бактерий, она является основным средством получения необходимой для жизни энергии у приспособленных к обитанию при отсутствии кислорода бактерий и различных грибков. Брожение - это разновидность ферментации, при которой ферменты вырабатываются исключительно микроорганизмами.

    Разновидности брожения.

      Микроорганизмы могут вызывать  брожение многих различных соединений, в том числе сахаров, жирных  кислот и аминокислот, причем  в каждом случае процесс идёт  немного по-другому. Чаще всего  встречается ферментация сахаров.  В результате брожения образуются  различные продукты - например, спирты  или молочная кислота - поэтому  выделяют, в частности, брожение  спиртовое, уксуснокислое, маслянокислое и молочнокислое.

    Как это происходит?

      В результате брожения сахаров  простые (глюкоза, фруктоза) или  сложные (мальтоза, сахароза, лактоза)  сахара разлагаются до этилового  спирта и окиси углерода. Процесс  проходит при участии дрожжей,  точнее зимазы (группы ферментов,  выделяемых дрожжами). Кроме спиртового  брожения, очень распространено  брожение молочнокислое, в результате  которого образуется молочная  кислота. При уксуснокислом брожении, в свою очередь, спирты окисляются  до уксусной кислоты, однако  в нём участвуют не дрожжевые  грибки, а особенные бактерии (семейства  Acetobacter). В процессе брожения образуются и другие продукты, однако во всех случаях выделяется энергия.

    Использование ферментации и  брожения.

      Явление ферментации широко используют  в пищевой, винной, пивоваренной  и спиртовой промышленности. Винное  брожение - то есть ферментация  сахаров, содержащихся в винограде  и других фруктах - применяется  для производства вина. Ферментационные  свойства дрожжей нашли применение  в пекарском деле, так как вырабатываемая  ими двуокись углерода (углекислый  газ) заставляет тесто "подходить". Уксусное брожение используется  в производстве уксуса. В природе  широко распространено сбраживание  белков, способствующее разложению  органических остатков; маслянокислое брожение в промышленности используют для производства масляной кислоты. Молочнокислое брожение применяется, например, для производства молочнокислых продуктов и квашения овощей. Кроме того, молочную кислоту используют в кожевенном и красильном производстве. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

6. Получение Bt-кукурузы

    Геном Bt-кукурузы содержит ген бактерии Bacillus thuringiensis, кодирующий белковый токсин, защищающий растения от насекомых-вредителей, в особенности кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis). Первый сорт Bt-кукурузы получил официально одобрение в 1996 году, после чего она быстро приобрела популярность, и в 2006 году уже около 35% кукурузных полей США было засеяно генетически модифицированными сортами.

    Ученые  университета штата Индиана установили, что пыльца и другие содержащие токсин растительные фрагменты могут попадать в водоемы, расположенные на расстоянии до двух километров от кукурузных полей, чему не придали значения при выдаче лицензии на выращивание Bt-кукурузы.

    Перед выдачей лицензии Агентство по охране окружающей среды провело испытания, с целью выявления возможного влияния Bt-кукурузы на водную флору  и фауну. Однако тестирование проводили  на традиционно используемых в таких  случаях ракообразных дафниях, а  не на родственных целевым организмам насекомых.

    В рамках проведенного в 2005-2006 годах в  интенсивно возделываемом регионе  на севере Индианы исследования авторы с помощью мусороуловителей оценили количество пыльцы и остатков Bt-кукурузы (листьев, початков и др.), попадающих в 12 рек и ручьев. Они продемонстрировали, что фрагменты Bt-кукурузы засоряют мелкие реки и ручьи, а во время бурь и ураганов могут перемещаться на значительные расстояния и попадать в крупные реки и озера.

    Они также обнаружили кукурузную пыльцу в пищеварительных органах части  ручейников, эволюционно являющихся близкими родственниками целевых насекомых-вредителей. Кроме того, лабораторные тесты показали, что употребление в пищу листьев Bt-кукурузы более чем на 50% снижает  скорость роста ручейников, являющихся важным пищевым ресурсом для рыб  и земноводных. А употребление другой разновидностью ручейников пыльцы Bt-кукурузы в концентрации, в 2-3 раза превышающей максимальную концентрацию, выявленную в местах проведения тестов, значительно увеличивает смертность насекомых

    Необходимо  отметить, что количество пыльцы и  растительных остатков Bt-кукурузы значительно  варьирует в зависимости от региона  и зависит от множества факторов. Это указывает на значительные географические вариации возможного отрицательного влияния  Bt-кукурузы на водные экосистемы.

    По  словам авторов, каждая новая технология ассоциирована с определенными  преимуществами и рисками и, возможно, риски, ассоциированные с промышленным культивированием Bt-кукурузы, на сегодняшний  день оценены не в полном масштабе.

    Устойчивость  к антибиотикам

      Ген устойчивости к ампициллину, который был интегрирован в Bt-кукурузу, оказался к тому же связан с регуляторной функцией (промотором) этого гена у бактерий. Этот промотор делает данный ген у бактерий весьма активным. Хорошо известно, что многие виды бактерий с готовностью захватывают в свой геном гены из окружающей их среды и интегрируют их в свою ДНК. Благодаря наличию этого промотора в кукурузе, велика вероятность того, что любая бактерия, которая случайно захватит этот ген, станет устойчивой к ампициллину. Таким образом, не исключено, что использование Bt-кукурузы породит поколения устойчивых к ампициллину бактерий.

      Пищеварительный тракт большинства  людей и животных содержит  множество полезных бактерий. Попадание  гена устойчивости к ампициллину в геном любого штамма таких бактерий опосредованно может породить также устойчивые к ампициллину патогенные бактерии. Если люди или животные съедят Bt-кукурузу, устойчивые к ампициллину бактерии могут оказаться в их кишечнике. Этот ген, возможно, будет захвачен уже присутствовавшими там полезными бактериями и патогенными микроорганизмами. Уже сейчас известно, что неправильное или избыточное применение антибиотиков породило "сверхпаразитов", устойчивых к широкому спектру антибиотиков. Коммерциализация Bt-кукурузы значительно усугубит данную проблему.

    Апологеты внедрения Bt-кукурузы не обсуждают  возможность передачи гена устойчивости к ампициллину в патогенные микроорганизмы. Вместо этого они пытаются оправдаться, утверждая, что устойчивость микробов к антибиотикам появляется, в том числе, с помощью прочих механизмов, например, при неправильном использовании антибиотиков. Это, по их мнению, позволяет не принимать всерьез опасность, исходящую от Bt-кукурузы.

      Опасность Bt-кукурузы  для здоровья человека

      На пути к внедрению Bt-кукурузы  компания Novartis столкнулась с действующими сейчас положениями США и ЕС о тестировании продукции на безопасность. Однако в случае Bt-кукурузы такого тестирования недостаточно для получения полной уверенности в безопасности. В США тестирование ГМ-продукции не является обязательным. Производители по закону не обязаны подвергать тестированию свою продукцию перед тем, как продавать ее. В Европе же тестирование обязательно. Однако и эти тесты вовсе не обязательно выявляют все возможные опасности ГМ-продукции. Это вызывается двумя взаимосвязанными причинами.

      Во-первых, процесс генной инженерии  не вполне конторолируем. В организмах, из которых производят потом пищевые продукты, могут произойти непредсказуемые изменения, в результате в пищевых продуктах могут оказаться аллергены или токсины, или же продукты потеряют часть своей питательности.

      Во-вторых, существующие положения  о тестировании непригодны из-за  того, что обычные и ГМ-продукты в этом случае считаются равнозначными. Тестирование ГМ-организмов, проводимое с применением такого принципа, обращает внимание либо на ранее известные факторы, по которым можно выявить потенциальные опасности, либо отдельно на свойства внедренных в ГМ-организм генов. При этом могут оказаться неучтенными новые свойства, проявляющиеся во взаимодействии вновь внедренных генов с исходными генами организма. При тестировании по такой программе, свойства ГМ-организмов сравниваются с таковыми у обычных организмов. Если эти характеристики у ГМ-продуктов и их обычных аналогов «равнозначны», то делается заключение, что поскольку обычные продукты в течение длительного времени были признаны безопасными по данному признаку, то и ГМ-продукция обладает теми же свойствами.

    Такой подход подразумевает молчаливое признание  того, что если обычный и аналогичный  ему ГМ-продукт признаны безопасными по ряду известных признаков, то оба эти продукта признаются безопасными для здоровья потребителей. Такой подход не годится из-за того, что при генной инженерии организмы приобретают иногда совершенно новые свойства.