Получение вакцин методом генной инженерии

После получения  двухцепочечной кДНК следует стадия получения гена, заключающаяся в  гидролизе одноцепочечного участка  ДНК, соединяющего первую и вторую цепи, нуклеазой S₁.

Для получения необходимых  участков РНК используют две группы способов: 1) расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданном месте; 2) синтез РНК (ферментативный на ДНК- или РНК-матрицах и химический).

Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в  присутствии различных ферментов. Для этой цели используют ферменты: рибонуклеазу H, нуклеазы, ковалентно связанные  с олигонуклеотидами (например, стафилококковая  нуклеаза), рибозимы (например, рибозим L-19).

Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК (называемой также  адресованной, сайт-направленной или  сайт-специфической фрагментацией  РНК) является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНК  ферментом РНКазой H в присутствии  комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов. Этот метод до сих пор остается наиболее универсальным способом направленной фрагментации РНК.

Метод основан на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепь РНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса. К участку РНК, по которому планируется  провести ее фрагментацию, синтезируется комплементарный олигодезоксирибонуклеотид длиной в 6-10 нуклеотидных остатков. Далее получают комплекс этого олигонуклеотида с РНК, который затем обрабатывают ферментом. В работе обычно используют РНКазу Н из Escherichia coli - вполне доступный фермент, который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазных примесей. Этот метод нашел достаточно широкое применение для сайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК, а также для идентификации продуктов процессинга некоторых РНК.

Важным достоинством рассматриваемого метода является и  то, что в результате гидролиза  РНК рибонуклеазой Н образуются фрагменты, у одного из которых на 5'-конце содержится фосфатная группа, а у другого 3'-конец свободен (нефосфорилирован). Такие фрагменты можно прямо использовать в реакции ферментативного лигирования.

Серьезным ограничением этого метода является то, что участок  РНК, с которым связывается комплементарный  ему олигодезоксирибонуклеотид, должен иметь однотяжевую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК, представляющей собой в условиях расщепления компактную глобулу с развитой вторичной структурой. В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть, используя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды (15-20-членные), которые предварительно отжигают с частично или п